![[Readers Insight] Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC): A Nemesis to Polar Compounds](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/1080_a134ed46-3aa6-4c67-878d-1c3786a088e9_750x.jpg?v=1782452257)
[Readers Insight] Гидрофильная хроматография (HILIC): извечный враг полярных соединений
Эта статья написана Сепусяньюнь. Содержание статьи отражает исключительно точку зрения автора.
Предыдущая статья:
Зачем добавлять муравьиную кислоту в подвижную фазу при масс-спектрометрии?
Введение
В практике жидкостной хроматографии вы когда-нибудь сталкивались с аналитами, которые трудно удерживаются на колонках C18? В предыдущих статьях мы обсуждали различные решения, которые имеют ограничения: добавление хаотропных агентов для увеличения удерживания, что работает только с определенными аналитами; добавление ион-парных реагентов, которые могут необратимо модифицировать стационарную фазу; и использование хроматографии смешанного режима, которая, однако, часто страдает от проблем с воспроизводимостью.
Если вы когда-либо сталкивались с такими аналитами, гидрофильная хроматография взаимодействия (HILIC) может быть хорошим выбором для вас.
Что такое HILIC?
Гидрофильная хроматография взаимодействия (HILIC) — это хроматографический режим, ортогональный как обращенно-фазовой, так и нормально-фазовой хроматографии. Стационарная фаза в HILIC является полярной, тогда как подвижная фаза использует то же, что и в обращенно-фазовой хроматографии.
Удержание в режиме HILIC не обусловлено одной доминирующей силой (например, гидрофобными взаимодействиями в обращенно-фазовой хроматографии), а комбинацией механизмов: жидкостно-жидкостное распределение, адсорбция, ионный обмен и гидрофильные взаимодействия. Поэтому как удерживание, так и форма пика для полярных соединений зависят от состава подвижной фазы (pH, органический растворитель и т. д.) и химии стационарной фазы.
Подобно нормально-фазовой хроматографии, в режиме HILIC ацетонитрил действует как слабый элюент, а вода как сильный элюент; чтобы подчеркнуть различие, HILIC иногда описывают как "обращенно-обращенно-фазовую".
Во время разделения на поверхности полярной стационарной фазы образуется слой полярного растворителя из подвижной фазы. Полярные аналиты склонны к распределению в этот полярный слой и таким образом удерживаются. Вследствие этого доля полярного растворителя в подвижной фазе HILIC обычно колеблется от 3% до 40% (иногда до 50%). Если она ниже 3%, стабильный полярный слой не может образоваться на поверхности стационарной фазы; если выше 40%, равновесие нарушается и режим становится обычной обращенно-фазовой хроматографией.
Как разрабатывать методы в режиме HILIC
В этом разделе мы представляем стратегии разработки методов в режиме HILIC.
Классификация стационарных фаз HILIC
Чистый диоксид кремния, диоловые фазы и т. д.: Эти стационарные фазы могут приобретать чистый отрицательный заряд в зависимости от pH и, таким образом, проявлять катионообменные свойства, что делает их пригодными для удерживания основных соединений. И наоборот, они склонны отталкивать анионы, что может сократить удерживание кислых видов.
Амино- и амидные фазы и т. д.: В отличие от предыдущих, эти фазы могут быть положительно заряжены путем регулирования pH и, таким образом, проявлять анионообменные свойства (обратите внимание, что амидные группы являются слабоосновными и могут не полностью ионизироваться, но фазы с амидными связями обычно имеют более длительный срок службы, чем аминовые фазы). Поэтому эти фазы хорошо подходят для удерживания кислых соединений. Поскольку полное концевое кепирование силанолов редко достижимо, остаточная ионизация силанолов все еще может придавать поверхности отрицательный заряд, что делает общие механизмы взаимодействия более сложными.
Цвиттерионные фазы (например, фазы на основе сульфобетаина): Эти фазы включают как анионные, так и катионные функциональные группы. Вместе с остаточными силанольными эффектами они создают еще более сложные механизмы и большее разнообразие селективности.
Выбор подвижной фазы
1. Элюирующая сила растворителей:
Относительная элюирующая сила в HILIC следует порядку: Ацетон < Ацетонитрил < Изопропанол < Этанол < Метанол < Вода. Ацетон и ацетонитрил считаются слабыми элюентами, тогда как спирты и вода считаются сильными.
Ацетон редко используется из-за его высокого порога УФ-поглощения и токсичности. Система ацетонитрил-вода остается наиболее часто применяемой.
В HILIC начальная доля ацетонитрила обычно превышает 70%, при этом водная доля постепенно увеличивается (противоположно тому, что используется в обращенно-фазовых системах). Если удерживание аналита остается недостаточным, добавьте небольшое количество спирта в водную фазу для регулирования удерживания.
2. Выбор буферов и добавок:
Учитывая высокое начальное содержание ацетонитрила, летучие соли аммония, такие как ацетат аммония и формиат аммония, предпочтительны из-за их совместимости с подвижными фазами, богатыми органическими растворителями. При использовании фосфатных буферов необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать осаждения. Добавление противоионов может улучшить как удерживание, так и форму пика.
3. Концентрация добавок:
При низких концентрациях буфера преобладают ионообменные взаимодействия. По мере увеличения концентрации буфера ионообменные эффекты постепенно подавляются, и в конечном итоге жидкостно-жидкостное распределение становится основным механизмом удерживания.
Для основных аналитов образование пар с анионами может увеличить кажущуюся гидрофобность и тем самым снизить удерживание. И наоборот, для кислых аналитов увеличение концентрации соли может подавить ионизацию силанолов и связанное с ней электростатическое отталкивание, что приводит к увеличению удерживания.
4. Выбор pH:
pH следует оценивать по кислотно-основным свойствам аналитов. Как правило, условия pH, способствующие ионизированному состоянию аналита, благоприятствуют его удерживанию в HILIC.
Например, на амидной колонке повышение pH вызывает отрицательный заряд кислых соединений, одновременно ионизируя поверхностные силанолы. Это приводит к увеличению полярности стационарной фазы, привлекая полярные растворители в подвижной фазе для адсорбции на поверхности стационарной фазы, утолщая полярный слой и облегчая распределение аналитов в этот слой, тем самым увеличивая удерживание. Однако одновременное увеличение ионизации силанолов также приводит к анионному отталкиванию. Этот пример подчеркивает сложную природу селективности HILIC.
Дальнейшие практические соображения
Как и другие хроматографические методы, HILIC имеет определенные практические ограничения. Ниже приведены две технические проблемы, которые необходимо решить:
- Время уравновешивания: Системы HILIC обычно требуют более длительного времени уравновешивания, чем системы с обращенной фазой. Это требование особенно очевидно при градиентном элюировании, где реэквилибрация после прогона должна быть продлена для обеспечения стабильности колонки.
- Эффекты растворителя: HILIC чаще всего используется для удерживания сильно полярных соединений, которые хорошо растворяются в воде. Если образцы готовятся в чистой воде в качестве растворителя для инъекции, могут возникнуть значительные эффекты растворителя, поскольку подвижная фаза обычно богата органикой. Поэтому важен тщательный выбор растворителя для образца. Если растворение в чистой воде неизбежно, поддержание высокой концентрации образца и низкого объема инъекции поможет минимизировать эффекты растворителя.
Следующая статья:
Градиентное или изократическое элюирование: что выбрать?
