[Readers Insight] Выбор подвижной фазы при разработке метода: как оптимизировать

В предыдущей статье мы изучали кислотность/основность через структуру соединения. Только понимая химическую структуру соединения, мы можем разработать научно обоснованный метод и решить, какую подвижную фазу и колонку выбрать на основе структуры. Естественно, анализ кислотно-основных свойств соединения является самым простым и фундаментальным первым шагом, а также наиболее важным.

В этой статье мы рассмотрим взаимосвязь между подвижной фазой и молекулярной структурой с точки зрения подвижной фазы.

В обычной обращенно-фазной хроматографии подвижная фаза обычно состоит из буферной соли и органического модификатора. Различные буферные соли и органические модификаторы могут быть скомбинированы многими способами, при условии, что две фазы взаимно смешиваемы.

Если пары примесей остаются неразрешенными после использования метанола, ацетонитрила или их смесей, попробуйте вышеуказанные менее распространенные органические модификаторы. Они могут дать неожиданно хорошие результаты для структур, которые трудно разделить традиционным обращенно-фазным методом, особенно для неэнантиомерных стереоизомеров и позиционных изомеров.

Если мы разрабатываем метод ВЭЖХ-УФ, выбирайте фосфатные буферы, где это возможно, из-за их низкой УФ-отсечки — они подходят для детектирования на низких длинах волн и предлагают три буферные области, обеспечивая большую селективность. Основным недостатком является худшая смешиваемость с органическими модификаторами; избегайте чрезмерно высоких органических процентов, чтобы предотвратить осаждение буфера и засорение прибора.

Ацетат аммония (CH₃COONH₄) и формиат аммония (HCOONH₄) лучше смешиваются с органическими растворителями и являются летучими, что делает их предпочтительными для ЖХ-МС. Их УФ-отсечка составляет ~210 нм, поэтому они менее подходят для УФ-работ на очень низких длинах волн. Ацетат также проявляет некоторый ионообменный характер по сравнению с фосфатом и, таким образом, может обеспечивать различную селективность.

Трифторуксусная кислота (ТФУК), благодаря сильному электроноакцепторному эффекту фтора, обладает более сильным ион-парным поведением и часто обеспечивает превосходные формы пиков для основных соединений. Добавки, подобные ТФУК, обычно имеют карбоксилатную головку и фторированный гидрофобный хвост, такие как пентафторпропионовая кислота (ПФПК), гептафторбутановая кислота (ПФБК/ГФБК) и нонафторпентановая кислота (ПФПнК) — различные длины цепей придают различное удерживание и селективность.

Следует отметить, что ТФУК в масс-спектрометре подавляет отклик отрицательных ионов, что ухудшает детектирование отрицательных ионов; надежно наблюдаются только сигналы положительных ионов.

Традиционные ионообменные реагенты использовались для аналитов, не удерживаемых обычной обращенно-фазной хроматографией; однако, поскольку они необратимо модифицируют колонки и требуют очень длительного времени переуравновешивания, они в основном вышли из употребления. Их в значительной степени заменили режимы HILIC, смешанный режим и новые хаотропные агенты/противоионы, которые не модифицируют стационарную фазу, могут улучшать форму пика для основных соединений и имеют более низкие УФ-отсечки (по сравнению с ≈210 нм у ТФУК).

Среди хаотропных реагентов перхлорат показывает лучшую смешиваемость с органическими растворителями, чем гексафторфосфат. Однако, поскольку ни один из них не является летучим, они несовместимы с масс-спектрометрией.

С другой стороны, сульфатные соли обычно используются в анализе пептидов и белков для изменения формы пика. Например, метод определения веществ, связанных с инсулином, в Китайской фармакопее использует подвижную фазу А, состоящую из 0,2 моль/л сульфатного буфера (28,4 г безводного сульфата натрия растворяют в воде, добавляют 2,7 мл фосфорной кислоты, регулируют pH до 2,3 этаноламином и доводят до 1000 мл водой) и ацетонитрила (82:18, об./об.).

Хлоридные соли (например, хлорид натрия, хлорид аммония) больше не являются предпочтительными, так как Cl⁻ вызывает коррозию нержавеющих стальных трубопроводов.

Следует с осторожностью отметить, что эти хаотропные реагенты не могут использоваться отдельно, поскольку они не обладают буферной емкостью; их необходимо использовать в сочетании с буферными солями.

Буферная емкость часто упускается из виду при разработке метода. Эффективная буферная емкость подвижной фазы относится к ее способности сопротивляться изменениям pH при добавлении растворенного вещества. Следующие факторы могут увеличить эффективную буферную емкость:

• Уменьшение разницы между pKa буфера и pH подвижной фазы.
  Например, основной диссоциационный диапазон фосфата имеет буферную область примерно между pH 2 и 3,5; если целевой pH равен 4, фосфат будет неэффективным буфером при pH 4.
• Увеличение разницы между pH подвижной фазы и pKa аналита.
  Из графиков pH–k мы знаем, что pH подвижной фазы, близкий к pKa соединения, оказывает наибольшее влияние на удерживание; поэтому pH подвижной фазы обычно поддерживается как минимум на ±1,5 единицы от pKa. Если разница достаточно велика, буферная емкость становится менее критичной.
• Увеличение концентрации буфера.
  5% уксусная кислота, упомянутая в статье "Начальная точка в разработке метода", вероятно, исходит из этого рассуждения.
• Уменьшение объема вводимой пробы.
  Меньшее количество пробы, диффундирующей в подвижную фазу, эффективно увеличивает буферную емкость.
• Регулировка pH пробы в соответствии с pH подвижной фазы.
  Большая разница в pH между раствором пробы и подвижной фазой может перегрузить буферную емкость.

В заключение, мы рекомендуем следующие начальные подвижные фазы:

• Для кислых соединений начинайте с 0,1% фосфорной кислоты. Обратите внимание, что для карбоновых кислот, если соединения содержат фосфатные эфиры, комплексообразование с металлами может привести к их хвосту; если содержат сульфогруппу, они могут оставаться ионизированными, поскольку обычные кислоты не могут подавлять ионизацию сульфокислот.
• Для основных или амфотерных соединений: начинайте с 0,1% фосфорной кислоты плюс 20 мМ гексафторфосфата калия (KPF₆) или 20 мМ перхлората натрия (NaClO₄), если целевые соединения соответствуют условиям pH.

Обе эти системы подвижных фаз имеют значения pH около 2,1 и, таким образом, удобно избегают областей pKa большинства кислых и основных соединений, снижая риск дрейфа времени удерживания и проблем с долговечностью.

С другой стороны, разделение примесей обычно может быть достигнуто путем скрининга различных колонок и органических модификаторов. Тем не менее, в ситуациях, когда доступные типы и количества колонок ограничены, а целевые аналиты, хотя и элюируют близко, отличаются по pKa, для их разделения может использоваться регулировка pH. Однако, когда pH находится в пределах ±1,5 единиц pKa соединения, небольшие колебания pH вызовут значительные изменения во времени удерживания; поэтому долговечность и робастность должны быть тщательно оценены.

Кроме того, в обращено-фазовых системах соли натрия и калия обычно ведут себя схожим образом, но гексафторфосфат калия (KPF₆) значительно дешевле гексафторфосфата натрия (NaPF₆), а перхлоратные соли являются регулируемыми материалами в большинстве стран и требуют соответствующей квалификации для покупки.