Влияние растворителя: скрытый убийца формы хроматографических пиков

В области ВЭЖХ (и УВЭЖХ) разработка метода часто сосредоточена на составе подвижной фазы, химии неподвижной фазы и параметрах прибора. Однако не менее важная переменная часто упускается из виду: растворитель образца.

Необъяснимое фронтирование пиков, расщепленные пики и сильное расширение полосы — это аномалии, которые регулярно возникают при аналитических измерениях. Аналитики могут часами устранять неполадки, пытаясь заменить колонку или промыть систему, только чтобы обнаружить, что простое уменьшение объема инжекции чудесным образом восстанавливает симметрию пика.

Это явление обусловлено тонкой, но разрушительной хроматографической переменной, связанной с растворителем образца, известной как эффект растворителя. Неспособность распознать и контролировать его приводит к ухудшению разрешения, ошибкам интегрирования и неточным качественным и количественным данным.

Чтобы понять, как эффект растворителя физически изменяет пик, процесс инжекции необходимо разделить на три отдельных хронологических этапа:

1. Этап 1: Зона пробы вымывается из петли инжектора и достигает начала колонки.
2. Этап 2: Зона пробы частично входит в колонку, взаимодействуя с неподвижной фазой.
3. Этап 3: Зона пробы полностью входит в колонку, и растворитель полностью вытесняется подвижной фазой.

Эффект растворителя в основном возникает и распространяется на этапе 2.

Когда зона пробы достигает неподвижной фазы, молекулы аналита на переднем крае зоны немедленно диффундируют в окружающую среду подвижной фазы. Поскольку подвижная фаза имеет более низкую элюотропную силу, эти молекулы нормально распределяются в неподвижной фазе и мигрируют с ожидаемой, более низкой скоростью (v_normal).

Однако молекулы аналита, остающиеся в ядре зоны пробы, окружены сильным растворителем для инжекции. Поскольку неподвижная фаза не может адекватно удерживать аналиты в присутствии этого сильного растворителя, эта фракция зоны аналита движется вниз по колонке со значительно ускоренной скоростью (v_fast).

В результате этого дифференциала скоростей полоса аналита физически расщепляется внутри колонки. Молекулы, захваченные в зоне сильного растворителя, продолжают опережать молекулы в зоне подвижной фазы, расширяя пространственный разрыв между ними.

По мере продвижения зоны сильного растворителя по колонке он не удерживается; он постепенно разбавляется и вытесняется поступающей подвижной фазой. Как только сильный растворитель разбавляется ниже критического порога, ускоренные молекулы аналита замедляются до нормальной скорости миграции. Однако пространственное разделение между двумя расщепленными полосами уже зафиксировано. Когда эти две различные полосы проходят через детектор, они выглядят как расщепленный пик или сильное фронтирование. Позже элюирующий пик соответствует молекулам, которые рано попали в среду подвижной фазы, что соответствует истинному времени удерживания соединения.

Наиболее надежным решением проблемы эффекта растворителя является согласование элюотропной силы разбавителя с исходной подвижной фазой. В обращенно-фазовых системах разбавитель в идеале должен содержать равную или меньшую концентрацию органического модификатора по сравнению с подвижной фазой. Если для начального растворения образца требуется сильный органический растворитель из-за ограничений растворимости, сначала следует приготовить высококонцентрированный исходный раствор. Затем этот раствор можно разбавить слабой подвижной фазой до конечной целевой концентрации перед инжекцией.

Интенсивность эффекта растворителя прямо пропорциональна объему вводимой пробки с сильным растворителем. Большой объем инжекции дольше поддерживает локализованную среду сильного растворителя, усугубляя расщепление полос. Минимизируя объем инжекции, небольшая пробка сильного растворителя быстро разбавляется подвижной фазой в начале колонки до того, как произойдет значительное расщепление полос.

При анализе ионизируемых соединений различия в pH между разбавителем образца и подвижной фазой могут вызывать нестабильное или дрейфующее время удерживания. Если разбавитель переводит аналит в состояние ионизации с более низким удерживанием, происходит фронтирование или расщепление. Аналитики должны отрегулировать pH разбавителя образца, чтобы он соответствовал подвижной фазе, или увеличить буферную емкость подвижной фазы, чтобы быстро подавить естественный pH введенной пробки образца.