![[Readers Insight] Gradient vs. Isocratic Elution: Which to Choose?](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/gradient-1080-105_750x.jpg?v=1782452237)
[Readers Insight] Градиентное и изократическое элюирование: что выбрать?
Эта статья написана Sepuxianyun. Содержание статьи отражает исключительно точку зрения автора.
Предыдущая статья:
Хроматография с гидрофильным взаимодействием: бич для полярных соединений
Введение
Выбор и настройка условий элюирования могут стать серьезной проблемой для новичков в области хроматографии. Когда следует выбирать градиентное элюирование, а когда изократическое? Это зависит от проводимого нами теста.
Например, если мы разрабатываем новый метод для родственных веществ, то мы склонны использовать градиентное элюирование из-за большого количества потенциальных пиков примесей. Но если анализируемое вещество содержит только одну примесь с полярностью, сходной с основным компонентом, изократическое элюирование может быть более подходящим, так как оно достаточно для их разделения и сокращает время анализа. Хотя в фармацевтической промышленности наличие только одной примеси — редкое явление.
Сравнение изократического и градиентного элюирования
| Режим элюирования | Преимущества | Недостаток |
|---|---|---|
| Изократическое элюирование | В целом, более короткое общее время выполнения; не требует повторной уравновешивания после выполнения. | Трудности с элюированием компонентов с сильно различающейся полярностью (слабополярные вещества могут не элюировать); пики, элюирующие поздно, страдают от уширения. |
| Градиентное элюирование | Подходит для веществ в широком диапазоне полярности; поддерживает четкие формы пиков как для рано, так и для поздно элюирующихся веществ. | Требует уравновешивания после выполнения для перезагрузки системы, увеличивая общее время цикла на инжекцию. |
Для каких сценариев подходят градиентное и изократическое элюирование?
Изократическое элюирование
- Анализ содержания: Поскольку целевой аналит обычно является только АФИ (активным фармацевтическим ингредиентом), изократическое элюирование предпочтительнее для минимизации времени выполнения на инжекцию. Соотношение органического модификатора должно быть отрегулировано таким образом, чтобы время удерживания основного пика находилось в пределах от 1/3 до 2/3 от общего времени выполнения. При использовании UPLC время выполнения может быть сокращено до одной минуты.
- Тестирование растворения: Для лекарств с низкой дозировкой ВЭЖХ используется для определения профилей растворения. Стратегия разработки отражает стратегию анализа содержания; однако необходимо оставаться бдительным в отношении эффектов растворителя, вызванных средами растворения.
- Анализ хиральных изомеров: Хиральные стационарные фазы обычно требуют более длительного времени уравновешивания по сравнению с колонками C18, особенно в системах с нормальной фазой. Использование градиентного элюирования с алканами и спиртами может вызывать значительное газовыделение (пузырьки), что приводит к колебаниям базовой линии. Поэтому стандартными являются ручное предварительное смешивание, ультразвуковая дегазация и изократическое элюирование. Если необходимо градиентное элюирование в обращенной фазе, время уравновешивания после выполнения должно быть увеличено для обеспечения равновесия колонки.
- Системы, использующие нелетучие ионообменные реагенты: Как катионные, так и анионные ионообменные реагенты требуют длительного времени уравновешивания. Следовательно, изократическое элюирование является обязательным. Внедрение градиента в этих системах часто приводит к нестабильности времени удерживания и частому появлению пиков-призраков.
- Детектирование по показателю преломления (RID): Принцип детектирования RID включает сравнение показателя преломления между ячейкой для образца и опорной ячейкой. Поскольку опорная ячейка содержит статический состав подвижной фазы, который нельзя регулировать в реальном времени, градиентное элюирование физически несовместимо с этим детектором.
Градиентное элюирование
- Гидрофобное взаимодействие в обращенной фазе: Это относится к стандартной ОФ-ВЭЖХ с использованием колонок C18, обычно применяемых для анализа родственных веществ. Поскольку основной движущей силой в системе C18 является гидрофобное взаимодействие, доля органической фазы (метанола или ацетонитрила) со временем увеличивается для элюирования слабополярных (гидрофобных) веществ.
Техническое примечание: Для данного соединения градиентный диапазон обычно простирается от 100% водной фазы (или 95%, если колонка не совместима со 100% водной фазой) до 100% органической. Верхний предел органической фазы должен определяться растворимостью добавок подвижной фазы. Например, 0,1% муравьиной кислоты хорошо смешивается с органическими растворителями, что позволяет элюировать 100% органическим растворителем. Однако при использовании фосфатных буферов с ацетонитрилом избыточные доли органической фазы могут вызвать осаждение соли в линии, что приводит к засорению прибора; чем выше концентрация фосфата, тем ниже допустимый предел органической фазы.
Если доступно программное обеспечение для моделирования, его можно использовать для прогнозирования pH-logD профиля соединения. Как правило, соединения со значениями logD от -2 до 5 подходят для удерживания в обращенной фазе. LogD < -2 указывает на чрезмерную полярность (отсутствие удерживания), тогда как LogD > 5 указывает на чрезвычайную гидрофобность (трудное элюирование). Для многокомпонентных смесей без программной помощи сначала следует провести "разведочный градиент" (полный градиент). В идеале первый пик должен элюировать примерно при 3×t₀ (мертвое время), а последний пик - примерно при 2/3 от общего времени выполнения, с последующей промывкой высокой концентрацией органической фазы для обеспечения полного элюирования.
При разработке градиентов количество точек перегиба (ступеней) должно быть минимизировано для обеспечения надежности метода. Большое количество сегментов увеличивает риск возникновения проблем при переносе метода, особенно из-за различий в объеме задержки между приборами разных марок. Для пиков, которые трудно разделить, может быть реализовано пологое градиентное плато.
- Температурный градиент: Используется в газовой хроматографии (ГХ) для анализа растворителей, где температура со временем увеличивается для элюирования веществ в зависимости от их соответствующих температур кипения.
- Градиент концентрации соли: Часто используется в ионообменной хроматографии (ИОХ). Как правило, более высокие концентрации соли увеличивают элюирующую способность. Две подвижные фазы отличаются только концентрацией соли, причем более высокая концентрация действует как сильный элюент.
- Градиент pH: Также применяется в ИОХ, где элюирующая способность зависит от зарядового состояния аналита и типа стационарной фазы. Это наиболее распространено в анализе белков.
Дополнительные слова
В процессе разработки метода оптимизация градиента часто второстепенна по отношению к выбору подходящей стационарной и подвижной фазы. Нередко два пика, которые не могут быть разделены независимо от настроек градиента, немедленно разделяются при переключении на другую химию колонки; таково значение селективности (α).
Кроме того, некоторые методы включают чрезмерно точные шаги градиента, например, 11,5% ацетонитрила. Это совершенно ненужно и контрпродуктивно. Помимо ошибок смешивания пропорциональных клапанов, если изменение состава на 1% приводит к потере разрешения, метод не обладает необходимой надежностью.
Нет «идеального» метода, есть только наиболее подходящий; лучший метод — это тот, который эффективно достигает аналитической цели.