Когда методы ЖХ не воспроизводятся: что может быть причиной?

В ВЭЖХ воспроизводимость является неизбежной и жизненно важной темой как для пользователей, так и для производителей. По сути, идеальная воспроизводимость может быть достигнута только при условии полного сохранения хроматографических условий, что означает не только параметры, записанные в наших экспериментальных журналах, но и каждую микропеременную во всей системе.

В данной статье для простоты мы разделяем хроматографическую систему на четыре основных компонента: реагенты, образцы, приборы и колонки. Чтобы сделать это обсуждение более практичным, мы исключим неизбежный фактор случайной ошибки и будем исходить из предположения, что сам аналитический метод является надежным и обладает разумной степенью устойчивости.

Обратите внимание, что эта статья основана на многолетнем опыте, накопленном Welch Materials, и посвящена в основном факторам прикладного уровня, которые легко упустить из виду в повседневной практике, а не ограничивается только самой колонкой.

Само собой разумеется, что качество реагентов является основным необходимым условием. При любой возможности всегда выбирайте реагенты наивысшего качества. Негативное влияние низкого качества реагентов часто проявляется не сразу, но со временем оно значительно снижает срок службы системы и воспроизводимость метода.

Помимо качества реагентов, внимания требуют и другие аспекты:

1. Изменения свойств реагентов

Свойства реагента не остаются статичными с момента его герметичной упаковки в бутылку до полного использования. Сдвиги происходят время от времени, особенно после воздействия окружающей среды:

• Улетучивание: Летучие реагенты улетучиваются, изменяя концентрацию раствора.
• Поглощение углекислого газа: Щелочные реагенты легко поглощают CO₂ из воздуха, изменяя свой pH и ионную силу.
• Поглощение влаги: Высокочистые растворители поглощают влагу из окружающей среды. Это особенно вредно для нормально-фазовых хроматографических систем, где следы воды резко сдвигают времена удерживания.

2. Присущие некоторым реагентам нестабильности

• Ацетат аммония: Этот реагент известен своей нестабильностью, особенно в отношении pH приготовленных из него растворов. Даже при использовании свежеоткрытых, высокочистых флаконов разница между флаконами может быть достаточно велика, чтобы изменить хроматографические результаты.
• Очищенная вода: Вода — это совершенно уникальный реагент в лаборатории. В то время как другие реагенты приобретаются в готовом виде с определенными уровнями чистоты, вода обычно производится на месте с помощью систем очистки или получается из коммерческой очищенной питьевой воды. Как известно, физические и химические свойства очищенной воды могут сильно колебаться по многим параметрам, и даже система очистки воды, показывающая сопротивление 18,2 МОм·см, не гарантирует отсутствие проблем с водой; проводимость — это лишь один из многих показателей качества.
  Совет от Welch Tech: Качество воды значительно варьируется в разных регионах мира и даже в пределах крупных стран. Особая осторожность требуется при попытке воспроизвести эксперименты в географически удаленных лабораториях.

Распространенное заблуждение среди пользователей заключается в том, что если основной анализируемый объект остается тем же, метод должен быть универсально применим. Однако основное назначение хроматографии — это разделение: даже если целевое соединение идентично, любое изменение других компонентов, включая примеси, вспомогательные вещества, матрицы и разбавители, изменит требования к хроматографическому разделению.

Это объясняет, почему активные фармацевтические ингредиенты (АФИ) и их готовые лекарственные формы часто требуют совершенно разных методов пробоподготовки и детектирования. При изменении матрицы образца исходные хроматографические условия часто теряют свою пригодность из-за следующих факторов:

• Эффекты растворителя: Изменения в растворителе образца (разбавителе) или объеме введения приводят к различным степеням эффектов растворителя, которые могут искажать форму пиков.
• Вариации матрицы и вспомогательных веществ: Изменения типа или концентрации вспомогательных веществ и матриц не только ухудшают детектирование, но также могут вызвать прямое, необратимое повреждение неподвижной фазы колонки. Это объясняет, почему колонки, используемые в анализе лекарственных форм и пищевых продуктов, обычно имеют более короткий срок службы, несмотря на тщательную очистку образцов.
• Реакционные смеси R&D: На этапе исследований и разработок состав и концентрация реакционных растворов значительно колеблются, что делает вариации в хроматографических результатах совершенно ожидаемыми.

Являясь самым дорогим компонентом хроматографической системы, приборы, используемые в большинстве лабораторий, произведены ведущими мировыми брендами. Им часто доверяют, и как следствие, мы часто упускаем из виду изменчивость, вызванную приборами.

Тем не менее, почти каждый хроматографист сталкивался с ситуацией, когда перенос метода на другой прибор или даже использование того же прибора после планового обслуживания приводило к изменению результатов.

1. Внеколоночный объем (мертвый объем)

Вредное воздействие внеколоночного объема на уширение пика хорошо известно и не требует комментариев.

Мы также наблюдали уникальное явление в практических применениях: когда внеколоночный объем между инжектором и входом колонки относительно велик, это позволяет образцу и подвижной фазе более тщательно смешиваться до достижения головной части колонки. Это может в некоторой степени смягчить сильные эффекты растворителя.

Однако современные высокопроизводительные приборы часто проектируются с минимизированными мертвыми объемами, и в результате иногда более подвержены эффектам растворителя из-за такого уменьшенного смешивания перед колонкой.

2. Фактический состав подвижной фазы (в изократических условиях)

В изократических условиях среда внутри колонки остается постоянной. До тех пор, пока прибор обеспечивает точное соотношение растворителей, проблем возникает мало. Два основных метода подачи подвижной фазы ведут себя по-разному:

• Ручное приготовление с однокамерной подачей: При условии строгого соблюдения стандартных рабочих процедур этот метод обеспечивает отличную стабильность.
• Внутриприборное онлайн-смешивание: Различные конструкции приборов приводят к вариациям в фактически подаваемых соотношениях. Системы смешивания низкого давления демонстрируют значительно более высокие ошибки при смешивании очень малых процентов растворителя. Кроме того, различия в конструкциях насосных модулей и логике смешивания (например, использование поправочных коэффициентов по сравнению с технологиями предварительного сжатия) приводят к расхождениям в фактическом выходе подвижной фазы между различными приборами.

3. Скорость потока в градиентных условиях

В условиях градиентного элюирования проблемы воспроизводимости значительно усиливаются. Поскольку среда подвижной фазы внутри колонки непрерывно меняется — и является неоднородной в разных частях колонки в любой момент времени — достижение идеальной воспроизводимости требует строгого контроля внутренней среды колонки в каждый последовательный момент. Это требует, чтобы соотношение растворителя и скорость потока, подаваемые на вход колонки, точно соответствовали времени.

Это делает скорость потока критичной при градиентном элюировании, поскольку она напрямую определяет скорость, с которой среда подвижной фазы изменяется внутри колонки. Напротив, незначительные изменения скорости потока в изократических условиях редко изменяют результат, поскольку селективность остается постоянной.

4. Градиентные профили: "Не то, что вы видите"

При оценке градиентов имейте в виду следующие важные технические факторы:

• Задержка градиента (мертвый объем): Параметры, настроенные в таблице градиента, определяют, когда модули прибора выполняют действие, а не когда конкретный состав подвижной фазы фактически достигает входа колонки.
• Поступенчатая подача градиента: Хотя программное обеспечение метода отображает плавную, непрерывную градиентную кривую (линейную или изогнутую), поршневые насосы возвратно-поступательного действия подают фиксированные пропорции растворителя за ход. Следовательно, фактическое изменение градиента представляет собой серию микроскопических "ступеней", а не истинно непрерывную кривую.
• Специфические для прибора градиентные кривые: Из-за различий в конструкции аппаратного обеспечения насоса и логике электронного управления, фактически подаваемая градиентная кривая неизбежно варьируется от одной модели прибора к другой. Эти вариации значительно усиливаются в мелких (пологих) градиентных профилях.

Хроматографическое поведение проявляется на высокомикроскопическом уровне, и даже современные теоретические основы не могут полностью объяснить каждое взаимодействие. Хотя Welch Materials является признанным производителем колонок, в этом разделе мы анализируем эти факторы на основе макроскопических параметров и теоретических моделей, чтобы предоставить систематическую основу для устранения неполадок.

1. Оборудование колонки

Хотя конструкция оборудования колонки сильно влияет на симметрию пика и распределение потока, технологии обработки и изготовления этих компонентов очень зрелые. Поэтому колебания качества оборудования колонки, как правило, минимальны, и их влияние на воспроизводимость ограничено, если модель оборудования остается неизменной.

2. Неподвижная фаза (упаковочный материал)

Следующий анализ параметров предполагает структуру с контролируемыми переменными:

Гарантия качества Welch: Конфигурации углеродной нагрузки продуктов Welch — особенно нашей классической серии — определяются обширной экспериментальной проверкой и десятилетиями обратной связи с рынком. В пределах разумных производственных допусков наши процессы минимизируют влияние неоднородности связывания на подавляющее большинство целевых соединений.

3. Технология упаковки колонки

Качество консолидации слоя колонки оказывает универсальное влияние на все аналиты. Этот фактор строго контролируется на заводе посредством жесткого тестирования эффективности колонки и симметрии пиков перед выпуском.