Раскрытие потенциала технологии дериватизации в анализе ВЭЖХ
В современной аналитической химии лабораторные аналитики часто сталкиваются с трудностями, когда некоторые соединения не поддаются обнаружению или разделению традиционными методами. Именно здесь на помощь приходит технология дериватизации — мощный инструмент, предназначенный для повышения чувствительности обнаружения и эффективности разделения.
В данной статье рассматривается применение методов дериватизации в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и их роль в преодолении аналитических препятствий.
Содержание
Что такое дериватизация?
Дериватизация подразумевает модификацию аналитов посредством химических реакций со специфическими реагентами, введение функциональных групп, которые улучшают их обнаруживаемость или разделяемость.
Широко используемый в различных инструментальных методах анализа, включая хроматографию (газовую, жидкостную, сверхкритическую, тонкослойную и капиллярный электрофорез), масс-спектрометрию, ЯМР-спектроскопию, УФ-видимый, флуоресцентный и электрохимический анализ, этот метод стал краеугольным камнем в решении аналитических задач.
Дериватизация в газовой хроматографии против жидкостной хроматографии
В газовой хроматографии (ГХ) дериватизация повышает летучесть образца и чувствительность обнаружения. В ВЭЖХ, напротив, дериватизация обычно использует реагенты (известные как дериватизирующие или маркирующие реагенты), которые реагируют с целевыми соединениями, образуя продукты, которые легче обнаружить или разделить.
Типы дериватизации в ВЭЖХ
Дериватизация методом ВЭЖХ позволяет решить различные проблемы, такие как плохое удерживание, нестабильность и низкая чувствительность, превращая аналиты в легко детектируемые производные. Этот процесс можно классифицировать по природе реакции, месту её проведения и интеграции с аналитическим прибором:
По формированию связей :
- Маркированные реакции : образуют ковалентные связи между аналитом и дериватизирующим реагентом.
- Немеченые реакции : включают нековалентные взаимодействия, такие как ионное спаривание, фотолиз, окислительно-восстановительные или электрохимические реакции.
По местоположению реакции :
- Предколоночная дериватизация : происходит до того, как образец попадает в хроматографическую колонку.
- Дериватизация в колонке : происходит внутри колонки.
- Постколоночная дериватизация : происходит после хроматографического разделения.
По интеграции приборов :
- Онлайн-дериватизация : полностью автоматизирована и интегрирована с прибором.
- Оффлайн дериватизация : проводится вручную перед аналитическим процессом.
- Дериватизация t -line : полуавтоматическая, с использованием специализированного оборудования для сложных рабочих процессов дериватизации.
Распространенные реакции в дериватизации ВЭЖХ
Универсальность метода ВЭЖХ-дериватизации проявляется в разнообразии используемых химических реакций, включая этерификацию, ацилирование, алкилирование, силилирование, боронообразование, циклизацию, ионизацию и фотохимические реакции. Выбор реакции зависит от характеристик аналита и аналитических целей.
Предколоночная дериватизация
Предколоночная дериватизация превращает аналит в детектируемое производное перед хроматографическим разделением. Этот метод может быть реализован как в режиме онлайн, так и офлайн.
- В режиме онлайн аналит и дериватизирующий реагент вводятся через отдельные насосы и смешиваются в режиме реального времени в реакторах.
- В автономном режиме сначала проводится реакция аналита и реагента, а полученное производное вводится в систему ВЭЖХ.
- Другой онлайн-метод предполагает включение в подвижную фазу дериватизирующих агентов для непосредственного взаимодействия с аналитом.
Постколоночная дериватизация
Постколоночная дериватизация подразумевает модификацию аналитов после их разделения в колонке ВЭЖХ для повышения их детектируемости. В этом методе разделяемые соединения реагируют с дериватизирующими реагентами до достижения детектора. Этот метод также подразделяется на дериватизацию в УФ-видимом спектре, флуоресцентную, рамановскую, электрохимическую и фотохимическую.
Ультрафиолетово-видимая (УФ-ВИС) дериватизация
УФ-дериватизация включает реакцию органических соединений, слабо или совсем не поглощающих УФ-излучение, с дериватизирующими реагентами, содержащими УФ-поглощающие группы, с образованием соединений, обнаруживаемых в УФ-диапазоне. Например, амины могут реагировать с галогенированными углеводородами, карбонильными или ацильными производными с образованием таких обнаруживаемых производных.
Видимая дериватизация служит двум основным целям:
- Обнаружение ионов переходных металлов : Ионы переходных металлов реагируют с хромогенными реагентами с образованием окрашенных комплексов, хелатов или ионно-ассоциированных соединений, которые затем можно обнаружить с помощью видимого света.
- Детектирование органических ионов : добавление противоионов аналита к подвижной фазе приводит к образованию окрашенных ионно-парных соединений. Эти соединения можно разделить и детектировать с помощью методов видимого света.
Флуоресцентная дериватизация
Флуоресцентная дериватизация представляет собой реакцию аналита с флуоресцентным дериватизатором с образованием флуоресцентного соединения для детектирования. Некоторые флуоресцентные реагенты сами по себе не обладают флуоресценцией, но образуют производные с высокой интенсивностью флуоресценции.
Хотя дериватизация повышает чувствительность и селективность, она также усложняет систему, увеличивает время и аналитические затраты. Более того, некоторые реакции дериватизации требуют строгого контроля условий реакции. Поэтому её рассматривают только в тех случаях, когда отсутствует удобный и чувствительный метод детектирования или требуется повышение селективности.
Фотохимическая дериватизация
Фотохимическая дериватизация (ФХД) — это метод, основанный на фотохимических реакциях и сочетающийся с другими методами детекции для повышения чувствительности и селективности. Флуоресценция является основным комбинированным методом, часто также используется электрохимический метод.
PCD расширяет сферу применения традиционных методов обнаружения и находит широкое применение при анализе фармацевтических препаратов, сложных биологических образцов и образцов окружающей среды.
Ключевые фотохимические реакции включают внутримолекулярный перенос энергии, столкновительный перенос энергии, тушение, фотоионизацию, изомеризацию, прямые реакции и межмолекулярный распад.
Фотохимический реактор WelView
3 192,00 долл. США 4 560,00 долл. США
Применение дериватизации ВЭЖХ
1. Обнаружение афлатоксина (фотохимическая дериватизация)
В данном случае фотохимическая дериватизация позволяет обнаруживать афлатоксин в низких концентрациях с помощью флуоресцентных детекторов, достигая более высокой чувствительности по сравнению с традиционными методами.
2. Анализ аминокислот в кормах (предколоночная дериватизация)
Колонка: Welch Ultisil Amino Acid (4,6×250 мм, 5 мкм)
3. Формальдегид в косметике (постколоночная дериватизация)
Применимо к различным косметическим формам, а именно: жидкостям на водной основе, кремам и лосьонам, гелям, жидкостям на масляной основе, на основе воска и пудре.
В зависимости от используемого детектора выбирается один из двух наборов условий, приведенных ниже:
Условия для детектора PDAD
| Столбец |
Колонка C18 (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм) или эквивалент |
| Подвижная фаза |
Раствор фосфорной кислоты |
| Скорость потока |
1,0 мл/мин |
| Температура колонки |
20 ℃ |
| Длина волны детектора |
420 нм |
| Объем впрыска |
10 мкл |
Условия для детектора FLD
| Столбец |
Колонка C18 (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм) или эквивалент |
| Подвижная фаза |
Раствор фосфорной кислоты |
| Скорость потока |
1,0 мл/мин |
| Температура колонки |
20 ℃ |
| Длина волны возбуждения |
425 нм |
| Длина волны излучения |
510 нм |
| Объем впрыска |
Условия постколоночной дериватизации
| Скорость потока дериватизационного раствора |
0,8 мл/мин |
| Температура реактора |
100 ℃ |
4. Таурин в глазных каплях (постколоночная дериватизация)
Приготовление испытуемого раствора:
Точно отмерьте 3 мл образца и перенесите его в мерную колбу объёмом 50 мл. Разбавьте водой до нужного объёма и тщательно перемешайте. Затем точно отмерьте 5 мл раствора и перенесите его в мерную колбу объёмом 100 мл. Разбавьте водой до нужного объёма и тщательно перемешайте.
Приготовление эталонного раствора:
Точно взвесьте необходимое количество стандартного образца таурина. Растворите и разбавьте водой для приготовления раствора с концентрацией приблизительно 0,15 мг/мл.
Хроматографические условия:
| Столбец |
колонка C18 |
| Подвижная фаза |
Фосфатный буферный раствор (pH 7,0) / ацетонитрил / вода = 70:15:15 |
| Температура колонки |
60 ℃ |
| Длина волны детектора |
338 нм |
Метод постколоночной дериватизации:
| Реагент для дериватизации |
Приготовьте раствор ортофталевого альдегида (ОПА) следующим образом: растворите 24 г гидроксида натрия и 43,2 г борной кислоты примерно в 2700 мл воды. Доведите pH до 4,0 серной кислотой, добавьте 2 мл 2-меркаптоэтанола и 10 мл 8%-ного этанольного раствора ОПА и разбавьте водой до 3000 мл (готовьте свежий раствор перед использованием). |
| Реакционная трубка из ПТФЭ |
Используйте реакционную пробирку с внутренним диаметром 1 мм и длиной около 40 см. |
| Температура дериватизации |
60 °С |
| Скорость потока реагента для дериватизации |
0,5 мл/мин |
| Объем впрыска |
10 мкл |
