Раскрытие потенциала технологии дериватизации в анализе ВЭЖХ

Дериватизация включает модификацию аналитов посредством химических реакций со специфическими реагентами, вводящими функциональные группы, которые улучшают их обнаруживаемость или разделимость.

Широко используемый в различных методах инструментального анализа, включая хроматографию (газовую, жидкостную, сверхкритическую, тонкослойную и капиллярный электрофорез), масс-спектрометрию, ЯМР-спектроскопию, УФ-видимый, флуоресцентный и электрохимический анализы, этот метод стал краеугольным камнем в решении аналитических задач.

Дериватизация в ВЭЖХ может решать различные проблемы, такие как плохое удерживание, нестабильность и низкая чувствительность, путем преобразования аналитов в легко обнаруживаемые производные. Этот процесс можно классифицировать по характеру реакции, месту реакции и интеграции с аналитическим прибором:

По образованию связей:

• Меченые реакции: Образуют ковалентные связи между аналитом и дериватизирующим реагентом.
• Немеченые реакции: Включают нековалентные взаимодействия, такие как ионное связывание, фотолиз, окислительно-восстановительные или электрохимические реакции.

По месту реакции:

• Предколоночная дериватизация: Происходит до того, как образец попадает в хроматографическую колонку.
• Наколонная дериватизация: Происходит внутри колонки.
• Постколоночная дериватизация: Происходит после хроматографического разделения.

По интеграции с прибором:

• Онлайн-дериватизация: Полностью автоматизирована и интегрирована с прибором.
• Офлайн-дериватизация: Проводится вручную до начала аналитического процесса.
• Встроенная дериватизация: Полуавтоматическая, с использованием специализированного оборудования для сложных процессов дериватизации.

Универсальность дериватизации ВЭЖХ очевидна в разнообразии химических реакций, которые она использует, включая этерификацию, ацилирование, алкилирование, силилирование, борирование, циклизацию, ионизацию и фотохимические реакции. Выбор реакции зависит от характеристик аналита и аналитических целей.

Постколоночная дериватизация включает модификацию аналитов после их разделения в колонке ВЭЖХ для улучшения их обнаруживаемости. В этом методе разделенные соединения реагируют с дериватизирующими реагентами до того, как достигнут детектора. Этот метод далее подразделяется на УФ-Вид, флуоресцентную, рамановскую, электрохимическую или фотохимическую дериватизацию.

Дериватизация в УФ-области спектра включает реакцию органических соединений со слабым или отсутствующим УФ-поглощением с реагентами для дериватизации, содержащими УФ-поглощающие группы, что приводит к образованию УФ-детектируемых соединений. Например, амины могут реагировать с галогенуглеводородами, карбонильными или ацильными производными, образуя такие детектируемые производные.

Дериватизация в видимой области спектра служит двум основным целям:

• Обнаружение ионов переходных металлов: Ионы переходных металлов реагируют с хромогенными реагентами, образуя окрашенные комплексы, хелаты или ион-ассоциированные соединения, которые затем детектируются с использованием видимого света.
• Обнаружение органических ионов: Путем добавления противоионов анализируемого иона к подвижной фазе образуются окрашенные ион-парные соединения. Эти соединения могут быть разделены и детектированы с помощью методов видимого света.

Флуоресцентная дериватизация включает реакцию анализируемого вещества с флуоресцентным дериватизирующим реагентом для образования флуоресцентного соединения для обнаружения. Некоторые флуоресцентные реагенты сами по себе не обладают флуоресценцией, но образуют высокофлуоресцентные производные.

Хотя дериватизация повышает чувствительность и селективность, она также увеличивает сложность системы, требует дополнительного времени и повышает аналитические затраты. Более того, некоторые реакции дериватизации требуют строгого контроля условий реакции. Таким образом, она рассматривается только тогда, когда нет удобного, чувствительного метода обнаружения или когда требуется повышение селективности.

Фотохимическая дериватизация (ФХД) — это метод, основанный на фотохимических реакциях, который сочетается с другими методами обнаружения для повышения чувствительности и селективности. Флуоресценция является основным комбинированным методом, и электрохимический метод также часто включается.

ФХД расширяет область применения традиционных методов обнаружения и находит широкое применение в анализе фармацевтических препаратов, сложных биологических образцов и образцов окружающей среды.

Ключевые фотохимические реакции включают внутримолекулярный перенос энергии, столкновительный перенос энергии, гашение, фотоионизацию, изомеризацию, прямые реакции и межмолекулярное разложение.

В этом приложении фотохимическая дериватизация позволяет обнаруживать афлатоксин в низких концентрациях с помощью флуоресцентных детекторов, достигая более высокой чувствительности, чем обычные методы.

Колонка: Welch Ultisil Amino Acid (4,6×250 мм, 5 мкм)

Применимо к различным формам косметики, а именно: жидкостям на водной основе, кремам и лосьонам, гелям, жидкостям на масляной основе, средствам на восковой основе и порошкам.

В зависимости от используемого детектора выбирается один из двух приведенных ниже наборов условий:

Условия для детектора PDAD

Условия для детектора FLD

Условия постколонной дериватизации

Приготовление исследуемого раствора:

Точно измерьте 3 мл образца и перенесите его в мерную колбу объемом 50 мл. Разбавьте до метки водой и хорошо перемешайте. Затем точно измерьте 5 мл раствора и перенесите его в мерную колбу объемом 100 мл. Разбавьте до метки водой и хорошо перемешайте.

Приготовление стандартного раствора:

Точно взвесьте соответствующее количество стандартного образца таурина. Растворите и разбавьте водой для получения раствора с концентрацией примерно 0,15 мг/мл.

Хроматографические условия:

Метод постколонной дериватизации: