Передовые стратегии улавливания полярных соединений в хроматографии: практические исследования и практическое применение
Оглавление
Введение
Анализ полярных соединений представляет собой постоянную проблему в аналитической химии, главным образом из-за их слабого удерживания, что часто препятствует надежному качественному и количественному анализу. С ростом спроса на анализ полярных соединений, таких как полярные лекарства, органические кислоты, нуклеотиды и алкалоиды, выбор подходящих режимов разделения и хроматографических колонок стал решающим вопросом для лабораторных аналитиков.
Эта статья рассматривает стратегии разработки методов анализа полярных соединений, включая:
- 1. Ключевые режимы разделения и их особенности.
- 2. Конкретные рекомендации по выбору колонок.
Выбор режимов разделения и ключевые аспекты
1) Обычная обращенно-фазовая хроматография
- Знакомая методология с высокой стабильностью.
- Широкий выбор доступных колонок.
- Ограниченное удерживание полярных соединений; стандартные колонки C18 могут страдать от «гидрофобного коллапса» в чистых водных фазах, что требует использования водоустойчивых колонок.
2) Ионно-парная обращенно-фазовая хроматография
- Добавление ион-парных реагентов в подвижную фазу для улучшения удерживания и формы пика ионных соединений с широкой применимостью.
- Требует более длительного уравновешивания колонки.
- Ион-парные реагенты изменяют химический состав колонки, сокращая ее срок службы и ограничивая совместимость с масс-спектрометрией (МС) из-за нелетучих реагентов.
3) Хроматография в смешанном режиме
- Сочетает несколько механизмов удерживания.
- Позволяет разделять сильно полярные соединения без ион-парных агентов в подвижной фазе.
- Менее знакома, что создает проблемы при разработке метода.
4) Ионообменная хроматография
- Подходит для ионизируемых соединений.
- Часто требует высоких концентраций солей или градиентов pH для элюирования, что может ограничивать совместимость с МС.
5) Жидкостная хроматография с гидрофильным взаимодействием (HILIC)
- Дополнительный режим к обращенно-фазовой хроматографии, где удерживание увеличивается с полярностью соединения.
- Высокое содержание органической подвижной фазы повышает чувствительность МС.
- Все более популярна, однако стабильность может быть менее постоянной, чем при обращенно-фазовой, что требует осторожной работы.
Выбор подходящей колонки для анализа полярных соединений
Welch Materials предлагает широкий выбор хроматографических колонок, разработанных для анализа полярных соединений:
1) Водоустойчивые колонки
Разработаны для подвижных фаз с высоким содержанием воды или чистой воды для улучшения удерживания полярных соединений.
Варианты включают:
- Ultisil® AQ-C18 – Торцевое покрытие с полярными группами.
- Ultisil® Polar RP и Ultisil® Alk C18 – Встроенные полярные группы.
- Ultisil® LP-C18 – Без торцевого покрытия.
2) Ионообменные колонки
Позволяет регулировать pH, ионную силу и органические модификаторы для лучшего удерживания ионных и сильно полярных образцов.
Варианты включают:
- Ultisil® XB-SAX (анионообменные).
- Ultisil® XB-SCX (катионообменные).
3) Колонки HILIC
Полярные стационарные фазы (такие как чистый диоксид кремния, амидные, аминогруппы) способствуют сильному удерживанию полярных и гидрофильных соединений.
Варианты включают:
- Ultisil® HILIC Silica – Чистый диоксид кремния.
- Ultisil® HILIC-NH2 – Аминофункциональная фаза.
- Ultisil® HILIC Amide – Амидофункциональная фаза.
- Ultisil® HILIC Amphion II – Цвиттерионная фаза.
4) Специализированные колонки
Специализированные колонки, разработанные для конкретных аналитов, таких как:
- Blossmate® SAX – Анализ глифосата.
- Xtimate® XB-SCX – Анализ метформина.
Стратегии и тематические исследования применения для удерживания полярных соединений
1) Обычная обращенно-фазовая хроматография
Проблема: Полярные соединения, такие как нуклеозиды и органические кислоты, демонстрируют слабое удерживание в обычной обращенно-фазовой хроматографии.
Стратегия: Для усиления удерживания полярных соединений часто используются подвижные фазы с высоким содержанием воды. Чем более полярны соединения, тем выше процентное содержание воды. Поэтому для получения более стабильных результатов предпочтительны водостойкие колонки.
Случай 1: Определение содержания гранул баньланьгэня (корня вайды)
Применение: Анализ традиционной китайской медицины
Подробности метода:
- Стандарт: Китайская Фармакопея
- Колонка: Ultisil® AQ-C18 (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: A: Вода; B: Метанол
- Скорость потока: 0,8 мл/мин
- Температура: 30°C
- Длина волны обнаружения: 254 нм
- Объем впрыска: 5 мкл
- Градиентное элюирование:
| Время (мин) | Фаза А (%) | Фаза В (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 3 | 97 | 3 |
| 20 | 90 | 10 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 50.1 | 97 | 3 |
| 65 | 97 | 3 |
2) Ионно-парная обращенно-фазовая хроматография
В случаях, когда даже 100% водная или буферная подвижная фаза обеспечивает недостаточное удерживание, ионно-парная обращенно-фазовая хроматография может быть хорошей стратегией с использованием
гидроксида тетрабутиламмония (TBAOH, Bu4NOH) или бромида тетрабутиламмония (TBAB) для кислых соединений и алкилсульфонатов (например, октансульфоната натрия) для щелочных соединений.
Случай 2: Количественное определение витамина B6
Применение: Анализ питательных веществ
Подробности метода:
- Стандарт: Китайская Фармакопея
- Колонка: Ultisil® XB-C18 (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: 0,04% раствор пентансульфоната натрия (pH отрегулирован до 3,0 уксусной кислотой) / Метанол = 85:15
- Скорость потока: 1,0 мл/мин
- Температура: 35°C
- Длина волны обнаружения: 291 нм
- Объем впрыска: 10 мкл
3) Режим ГИЛХ
Режим ГИЛХ (гидрофильной интерактивной жидкостной хроматографии) — это гидрофильный интерактивный режим, который сочетает в себе жидкостно-жидкостное распределение, ионообмен и силы водородных связей. Он изменяет селективность разделения за счет межполярных сил и усиливает удерживание высокополярных веществ.
Случай 3: Определение бетаина в ягодах годжи
Применение: Биохимический анализ натуральных продуктов
Бетаин — это высокополярное соединение с logP -3,1 при 20 ℃, демонстрирующее слабое удерживание в обычных обращенно-фазовых системах.
Подробности метода:
- Стандарт: Китайская Фармакопея
- Колонка: Ultisil® HILIC-NH2 (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: Ацетонитрил/Вода = 85:15
- Скорость потока: 1,0 мл/мин
- Температура: 30°C
- Длина волны обнаружения: 195 нм
- Объем впрыска: 5 мкл
Случай 4: Анализ эрготионеина
Применение: Исследование антиоксидантов
Эрготионеин является природным антиоксидантом с сильной полярностью и как положительным, так и отрицательным зарядами. В данном случае мы используем цвиттерионную колонку HILIC Amphion II для адекватного удерживания.
Подробности метода:
- Колонка: Ultisil® HILIC Amphion II (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: Ацетонитрил/Вода = 78:22
- Скорость потока: 1,0 мл/мин
- Температура: 30°C
- Длина волны обнаружения: 254 нм
- Объем впрыска: 20 мкл
4) Специализированные колонки
Случай 5: Определение глифосата в сырье
Применение: Анализ полярных пестицидов
Традиционные колонки C18 с обращенной фазой с трудом удерживали глифосат из-за его крайней полярности. Для эффективного удержания глифосата использовалась колонка Blossmate® SAX, разработанная для анализа полярных пестицидов. Механизм сильного анионного обмена обеспечил стабильное удержание и разделение, при этом целевой пик элюировался в течение 5 минут.
Подробности метода:
- Колонка: Blossmate® SAX (4.6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: 100 мМ KH₂PO₄/Метанол = 85:15 (pH доведено до 2.0)
- Скорость потока: 1.0 мл/мин
- Температура: 25°C
- Длина волны обнаружения: 195 нм
- Объем впрыска: 20 мкл
Информация для заказа
| Номер детали | Название продукта | Спецификация |
| 00207-31043 | Ultisil® AQ-C18 | 4.6×250 мм, 5 мкм |
| 00215-31043 | Ultisil® Polar RP | |
| 00253-31043 | Ultisil® Alk C18 | |
| 00208-31043 | Ultisil® LP-C18 | |
| 00201-31043 | Ultisil® XB-C18 | |
| 00213-31043 | Ultisil® XB-SAX | |
| 00212-31043 | Ultisil® XB-SCX | |
| 00228-31043 | Ultisil® HILIC Silica | |
| 00231-31043 | Ultisil® HILIC-NH2 | |
| 00240-31043 | Ultisil® HILIC Amide | |
| 00274-31043 | Ultisil® HILIC Amphion II | |
| 00606-31043 | Blossmate® SAX | |
| 00120-21043 | Xtimate® XB-SCX |