Передовые стратегии улавливания полярных соединений в хроматографии: практические исследования и практическое применение
Анализ полярных соединений представляет собой постоянную проблему в аналитической науке, прежде всего из-за их слабого удерживания, что часто затрудняет проведение надёжного качественного и количественного анализа. В связи с растущим спросом на анализ полярных соединений, таких как полярные лекарственные препараты, органические кислоты, нуклеотиды и алкалоиды, выбор подходящих режимов разделения и хроматографических колонок стал важной задачей для лабораторных аналитиков.
В данной статье рассматриваются стратегии разработки методов анализа полярных соединений, включая:
- 1. Основные режимы разделения и их рассмотрение.
- 2. Конкретные рекомендации по выбору столбцов.
Содержание
Выбор режимов разделения и основные соображения
1) Обычная обращенно-фазовая хроматография
- Знакомая методология с высокой стабильностью.
- Широко доступные варианты колонок.
- Ограниченное удерживание полярных соединений; стандартные колонки C18 могут страдать от «гидрофобного коллапса» в чистых водных фазах, что требует использования колонок, устойчивых к воде.
2) Ион-парная обращенно-фазовая хроматография
- Добавляет ион-парные реагенты в подвижную фазу для улучшения удерживания и формы пика ионных соединений, обеспечивая широкую применимость.
- Требует более длительного уравновешивания колонки.
- Ион-парные реагенты изменяют химию колонки, сокращая ее срок службы и ограничивая совместимость с масс-спектрометрией (МС) из-за нелетучих реагентов.
3) Смешанная хроматография
- Сочетает в себе несколько механизмов удержания.
- Позволяет разделять сильнополярные соединения без использования ион-парных агентов в подвижной фазе.
- Менее известен, вызывает трудности при разработке метода.
4) Ионообменная хроматография
- Подходит для ионизируемых соединений.
- Часто для элюирования требуются высокие концентрации солей или градиенты pH, что может ограничить совместимость с МС.
5) Гидрофильная жидкостная хроматография (HILIC)
- Дополнительный режим обращенно-фазовой хроматографии, где удерживание увеличивается с полярностью соединения.
- Высокое содержание органической подвижной фазы повышает чувствительность МС.
- Становится все более популярным, однако стабильность может быть менее постоянной, чем при обращенно-фазовой технологии, что требует осторожной эксплуатации.
Выбор правильной колонки для анализа полярных соединений
Компания Welch Materials предлагает широкий выбор хроматографических колонок, предназначенных для анализа полярных соединений:
1) Водостойкие колонны
Разработан для подвижных фаз с высоким содержанием воды или чистой воды для улучшения удерживания полярных соединений.
Возможны следующие варианты:
- Ultisil® AQ-C18 – с концевыми полярными группами.
- Ultisil® Polar RP и Ultisil® Alk C18 – Содержат встроенные полярные группы.
- Ultisil® LP-C18 – без концевой группы.
2) Ионообменные колонки
Позволяет регулировать pH, ионную силу и органические модификаторы для лучшего удерживания ионных и высокополярных образцов.
Возможны следующие варианты:
- Ultisil® XB-SAX (анионообмен).
- Ultisil® XB-SCX (катионообменник).
3) Колонки HILIC
Полярные неподвижные фазы (такие как чистый диоксид кремния, амид, аминогруппы) способствуют прочному удерживанию полярных и гидрофильных соединений.
Возможны следующие варианты:
- Ultisil® HILIC Silica – чистый диоксид кремния.
- Ultisil® HILIC-NH2 – Амино-связанная фаза.
- Ultisil® HILIC Amide – фаза с привитыми амидами.
- Ultisil® HILIC Amphion II – цвиттерионная связанная фаза.
4) Специализированные колонки
Специальные колонки, предназначенные для определенных аналитов, таких как:
- Blossmate® SAX – Анализ на глифосат.
- Xtimate® XB-SCX – Анализ метформина.
Стратегии и примеры применения для удержания полярных соединений
1) Обычный обратнофазный
Задача: Полярные соединения, такие как нуклеозиды и органические кислоты, демонстрируют слабое удерживание в традиционной обращенно-фазовой хроматографии.
Стратегия: Для улучшения удерживания полярных соединений часто используются подвижные фазы с высоким содержанием воды. Чем больше полярных соединений, тем выше содержание воды. Поэтому для получения более стабильных результатов предпочтительны колонки, устойчивые к воде.
Случай 1: Определение содержания гранул Банлангена (корня Исатиса)
Применение: анализ традиционной китайской медицины
Подробности метода:
- Стандарт: Китайская фармакопея
- Колонка: Ultisil® AQ-C18 (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: A: Вода; B: Метанол
- Скорость потока: 0,8 мл/мин
- Температура: 30°С
- Длина волны обнаружения: 254 нм
- Объем инъекции: 5 мкл
- Градиентное элюирование:
| Время (мин) | Фаза А (%) | Фаза B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 3 | 97 | 3 |
| 20 | 90 | 10 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 50.1 | 97 | 3 |
| 65 | 97 | 3 |
2) Ионная пара обращенной фазы
В случаях, когда даже 100% вода или буферная солевая подвижная фаза обеспечивают недостаточное удерживание, ион-парная обращенно-фазовая хроматография может быть хорошей стратегией, используя
гидроксид тетрабутиламмония (TBAOH, Bu 4 NOH) или бромид тетрабутиламмония (TBAB) для кислотных соединений и алкилсульфонаты (например, октансульфонат натрия) для щелочных соединений.
Случай 2: Количественное определение витамина B6
Применение: Анализ состава пищевых веществ
Подробности метода:
- Стандарт: Китайская фармакопея
- Колонка: Ultisil® XB-C18 (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: 0,04% раствор пентансульфоната натрия (pH доведен до 3,0 уксусной кислотой) / метанол = 85:15
- Скорость потока: 1,0 мл/мин
- Температура: 35°С
- Длина волны обнаружения: 291 нм
- Объем инъекции: 10 мкл
