[Взгляд читателя] Введение в общие методы дериватизации и примеры применения
Эта статья написана экспертом-хроматографистом Хроматографи Маунд. Содержание статьи представляет исключительно точку зрения автора. Welch Materials, Inc. имеет право перевести эту статью на английский язык и опубликовать ее от имени автора.
Введение
Дериватизация является часто используемым методом предварительной обработки с целью повышения чувствительности детектора, увеличения хроматографической удерживаемости целевых аналитов, изменения полярности для облегчения экстракции или разделения примесей.
Однако выбор подходящего метода дериватизации, или даже решение о необходимости дериватизации, зависит от таких факторов, как структура и свойства целевого соединения, метод предварительной обработки и тип детектора. Эти соображения делают эту тему сложной и достойной обсуждения.
Основываясь на проблемах, возникающих в ходе экспериментов, и принципах применяемых методов дериватизации, автор обобщил несколько подходов к дериватизации для расширения их применения в пробоподготовке.
1. Метилирование гидроксильных групп
Применение:
Этот метод предназначен для соединений, содержащих гидроксильные группы, таких как метанол и этанол. Метилирование снижает полярность, облегчая отделение от водорастворимых примесей.
Обычные реагенты:
Йодид метила и диметилсульфат в сильнощелочных условиях.
Условия реакции:
Добавить 0,5 мл 4 моль/л раствора гидроксида натрия при комнатной температуре, энергично встряхнуть, оставить на 15 минут, затем добавить 0,5 мл йодида метила и встряхивать на вортексе в течение 10 минут.
Механизм реакции:
Гидроксильная группа (-OH) реагирует с гидроксид-ионами (OH⁻) с образованием –ONa и воды, после чего следует реакция с CH₃I с образованием –OCH₃ и NaI.
Ограничения:
Целевое соединение должно оставаться стабильным в сильнощелочной среде, а гидроксильная группа должна проявлять явную реакционную способность.
2. Образование амидов из гидроксильных или аминогрупп
Применение:
Этот метод используется для соединений, содержащих гидроксильные или аминогруппы, таких как алкиламины, биогенные амины и стеролы. Образование амидов снижает полярность. Амины, реагирующие с ацилхлоридами, могут вводить специфические функциональные группы, такие как ароматические кольца, для аналитических целей.
Условия реакции:
Добавить по 5 мл 0,4% бензилхлорформиата и 1% раствора карбоната натрия, затем инкубировать на водяной бане при 60°C в течение 2 часов.
Механизм реакции:
Гидроксильная (-OH), амино (-NH₂) или вторичные аминогруппы (-NH-) реагируют с RCOCl с образованием RCO-NH- и HCl. Реакция ускоряется в слабощелочных условиях, и по мере необходимости могут быть введены специфические R-группы (например, УФ- или флуоресцентно-поглощающие группы).
3. Реакция переэтерификации
Применение:
(Это сложная реакция, и здесь показан только один пример.)
Этот метод нацелен на различные эфирные формы кислот, такие как жирные кислоты. Переэтерификация с метанолятом калия (KOCH₃) или спиртами (ROH) превращает кислоты в единую эфирную форму (например, метиловый эфир). R-группа, вводимая ROH, может быть адаптирована для аналитических нужд.
Условия реакции:
Добавить 5 мл 10% раствора ацетилхлорида в метаноле и инкубировать на водяной бане при 60°C в течение 2 часов.
Механизм реакции:
R₁CO-OR₂ реагирует с CH₃O⁻ с образованием R₁CO-OCH₃ и R₂OH.
4. Введение галогена
Применение:
Редко используемый в практических определениях, этот метод применяется к таким соединениям, как сахарин и алкиламины. Введение галогенных групп может придать УФ-поглощение соединениям, не имеющим сопряженных структур. Доступны различные реакции замещения галогена, но приводятся только практические примеры из аналитических испытаний.
Условия реакции:
Добавить 5 мл 50% серной кислоты и 5 мл гипохлорита натрия (эффективный хлор: 15%-20%) и реагировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
Механизм реакции:
В сильнокислой и окислительной среде аминогруппы (-NH-R или -NR₂) реагируют с гипохлоритом с образованием связей N-Cl, которые проявляют УФ-поглощение.
5. Гидролиз ангидридов или лактонов
Применение:
Этот метод подходит для таких соединений, как бензойный ангидрид и малеиновый ангидрид. Соединения без легкоионизируемых групп часто проявляют низкую чувствительность в масс-спектрометрии из-за отсутствия ионизируемых участков. Гидролиз вводит карбоксильные группы с более высокой электрофильностью, повышая чувствительность.
Условия реакции:
Добавить 3 мл 10% азотной кислоты и инкубировать на водяной бане при 60°C в течение 3 часов.
Механизм реакции:
См. изображение ниже.
6. Дериватизация α-аминокислот
Применение:
Поскольку аминокислоты хорошо растворимы в воде и не поглощают УФ-излучение, дериватизация вводит сопряженные структуры, такие как ароматические кольца. Это снижает полярность, увеличивает хроматографическую удерживаемость и обеспечивает максимальное УФ-поглощение при 260 нм.
Условия реакции:
Растворить аминокислоты в водном растворе, содержащем 60% пиридина и соответствующее количество фенилизотиоцианата (PITC), затем инкубировать на водяной бане при 40°C в течение 1 часа.
Механизм реакции:
PITC реагирует с аминокислотами с образованием фенилтиокарбамоильных производных (PTH-аминокислот).
Заключение
В дополнение к описанным выше методам дериватизации, также широко используются такие реакции, как силилирование и образование гидразонов между альдегидами и фенилгидразином.
Перед применением дериватизации крайне важно четко определить ее цель, учитывая стабильность соединения (в условиях реакции), требуемые функциональные группы, модификации полярности и оптимизацию хроматографического поведения. Реакционная способность функциональных групп и условия реакции должны быть тщательно выбраны и оптимизированы для достижения наилучшего результата.
Дериватизация должна быть целенаправленной и направленной на достижение наилучших результатов с минимальными усилиями, избегая ненужной дериватизации, которая отвлекает от аналитического процесса.