Хроматография гидрофобных взаимодействий: ваш лучший помощник в анализе конъюгатов антител с лекарственными препаратами

Конъюгаты антитело-лекарство (КАЛ) — это сложный класс таргетных противораковых препаратов. Они состоят из трех неотъемлемых компонентов: антитела, химического линкера и мощного цитотоксического вещества. Используя специфичность антитела для распознавания ассоциированных с опухолью антигенов, КАЛ доставляет токсическое вещество непосредственно в злокачественные клетки, минимизируя системную токсичность и максимизируя терапевтическую эффективность.

КАЛ часто описывают как "биологические бомбардировщики", но сколько ракет несет один КАЛ? Этот критический атрибут качества называется отношением препарата к антителу (DAR). DAR представляет собой количество молекул цитотоксического препарата, присоединенных к каждому антителу. Для каждого конъюгата это значение является четным числом (0, 2, 4 или более), а для одного препарата КАЛ нас интересует среднее количество каждого КАЛ.

DAR является основным определяющим фактором "огневой мощи" препарата. Если DAR слишком низок, его потенции может быть недостаточно для достижения клинических результатов; если он слишком высок, КАЛ может стать нестабильным, слишком быстро выводиться из системного кровообращения или приводить к повышенной токсичности. Точность определения DAR поэтому имеет первостепенное значение как для исследований и разработок, так и для контроля качества этих сложных биологических препаратов.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является стандартным инструментом для анализа DAR. Однако традиционная обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) может быть "жесткой" по отношению к структуре белка, что потенциально приводит к денатурации или диссоциации нативной конформации КАЛ.

В отличие от этого, хроматография гидрофобных взаимодействий (HIC) является "мягким" подходом, который разделяет компоненты на основе различных степеней гидрофобности. Ее механизм элегантен: в то время как чистое антитело относительно гидрофильно, конъюгированные низкомолекулярные препараты, как правило, сильно гидрофобны. Следовательно, по мере увеличения количества молекул препарата, присоединенных к антителу, общая гидрофобность молекулы КАЛ пропорционально увеличивается.

HIC выступает в качестве тщательного организатора, разделяя виды КАЛ от низких до высоких значений DAR на основе этой возрастающей гидрофобности, что позволяет определять распределение DAR и рассчитывать среднее значение DAR одновременно в одном анализе.

Выбор колонки оказывает большое влияние на качество разделения. Например, колонка Advanchrom Bio HIC-Butyl от Welch Materials является отличным универсальным выбором для большинства антител и КАЛ. Она обычно использует стандартную буферную систему сульфата аммония для достижения надежного разделения.

Для антител, белков и КАЛ с меньшей гидрофобностью колонка Advanchrom HIC-Butyl предлагает сильный вариант. Она особенно совместима с летучими, масс-спектрометрически совместимыми системами подвижной фазы (такими как ацетат аммония и ацетонитрил). Это позволяет более точно и быстро сопоставлять результаты ЖХ-УФ и ЖХ-МС, облегчая идентификацию специфических видов DAR.

Основной принцип работы HIC — это высокосолевая загрузка и низкосолевая элюция. Анализ начинается с высокой концентрации соли в качестве начальной подвижной фазы, чтобы все компоненты КАЛ связались со стационарной фазой. Затем концентрация соли в подвижной фазе постепенно снижается, заставляя компоненты "сдаваться" (элюироваться) в порядке их гидрофобности — компоненты с самым низким DAR элюируются первыми, за ними последовательно следуют компоненты с постепенно увеличивающимся DAR.