![[Readers Insight] HPLC Column Selection: Core to Method Development (Part I)](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/columnselection2-1080-1105_750x.jpg?v=1773724222)
[Мнение читателя] Выбор колонки для ВЭЖХ: основа разработки метода (Часть I)
Эта статья написана Сепусяньюнь. Содержание статьи отражает исключительно точку зрения автора.
Предыдущая статья:
Выбор подвижной фазы при разработке метода: как оптимизировать
Введение
Хроматографическая колонка — это сердце разделения. Помимо подвижной фазы, колонка является наиболее влияющим фактором, воздействующим на селективность (α).
| Условие | k | α | N |
|---|---|---|---|
| Содержание фазы B | ++ | + | − |
| Растворитель фазы B (ACN, MeOH и т.д.) | + | ++ | − |
| Температура | + | + | + |
| Тип колонки (C18, фенил, циано и т.д.) | + | ++ | − |
| pH подвижной фазы | ++ | ++ | + |
| Концентрация буфера | + | + | − |
| Концентрация IPR | ++ | ++ | + |
| Длина колонки | 0 | 0 | ++ |
| Размер частиц | 0 | 0 | ++ |
| Скорость потока | 0 | 0 | + |
| Давление | − |
− |
+ |
(++: наиболее влиятельный; +: влиятельный; −: менее влиятельный; 0: не влияет)
Однако, даже в категории колонок C18 уже существуют тысячи вариантов на рынке, не говоря уже о других привитых фазах. Какая из них лучшая? Мне часто задают этот вопрос, и мой ответ всегда таков: качество колонки зависит от ее производственного процесса, а не от типа C18.
Хорошая ВЭЖХ-колонка определяется стабильным качеством производства и превосходной воспроизводимостью от партии к партии. Это одна из самых больших проблем для производителей колонок — если метод не может быть воспроизведен после замены колонки на другую той же модели, такая колонка имеет малую коммерческую ценность.
Что касается типа C18, нет хорошего или плохого, а есть только подходящий или неподходящий. Лучшая колонка — это та, которая наиболее совместима с вашим аналитом. Быть подходящим и быть хорошим — это два разных понятия, и их не следует путать. В этой статье я надеюсь дать более четкое представление о том, как выбирать и классифицировать ВЭЖХ-колонки.
Классификация ВЭЖХ-колонок
ВЭЖХ-колонки могут быть классифицированы различными способами. Наиболее распространенные классификации — по основному материалу и по привитой фазе. Различные комбинации этих двух факторов (особенно для материалов на основе диоксида кремния) приводят к широкому спектру типов колонок.
Классификация по основному материалу
1. Колонки на основе диоксида кремния
Более 90% коммерческих ВЭЖХ-колонок используют диоксид кремния в качестве основного материала благодаря его высокой устойчивости к давлению и превосходной модифицируемости поверхности для связывания различных стационарных фаз. Диоксид кремния значительно эволюционировал со временем — от раннего аморфного диоксида кремния (который содержал много ионов металлов) до сферического диоксида кремния, и теперь до ультрачистого диоксида кремния (чистота до 99,999%) и гибридного диоксида кремния (который может выдерживать уровни pH до 12). Эти разработки позволили диоксиду кремния оставаться на вершине иерархии наполнителей для колонок.
Колонки с диоксидом кремния типа «ядро-оболочка», обеспечивающие быстрый анализ при более низком противодавлении, также становятся все более популярными благодаря их эффективности и производительности.
2. Колонки на полимерной основе
Полимерные наполнители обеспечивают отличную химическую стабильность в широком диапазоне pH (обычно pH 0–14) и даже могут быть адаптированы для создания хиральной среды для разделения энантиомеров. Однако они обычно имеют более низкую устойчивость к давлению и меньшую воспроизводимость от партии к партии. По этой причине колонки на полимерной основе используются менее широко, чем колонки на основе диоксида кремния.
3. Графитированные углеродные колонки
Полученные из сажи путем высокотемпературной графитизации, эти материалы обладают уникальными физико-химическими свойствами. Они могут выдерживать экстремальные условия pH (0–14) и высокие температуры, обеспечивая хорошее удерживание для высокополярных соединений.
4. Металлорганические и ковалентно-органические каркасы (MOF и COF)
Эти новые материалы отличаются высокой площадью поверхности, настраиваемыми размерами пор, химической стабильностью и гибкостью дизайна, предлагая большой потенциал для эффективной адсорбции и быстрого разделения. Однако они еще не достигли коммерческой доступности. Нобелевская премия по химии 2025 года была присуждена японскому ученому Сусуму Китагаве, австралийскому ученому Ричарду Робсону и американскому ученому Омару Яги за их новаторский вклад в разработку MOF-материалов.
Классификация по привитой фазе
В этой статье мы сосредоточимся только на обращенно-фазовой привитой фазе.
1. Октадецил (C18)
Наиболее часто используемая привитая фаза, и она может быть дополнительно подразделена по типу связывания, концевой блокировке и функциональным модификациям:
- Тип связывания: Колонки могут иметь моно-, ди- или трифункциональное связывание, а также бидентатное связывание, при этом трифункциональные колонки C18 предлагают более высокую стабильность, но требуют более сложных производственных процессов.
- Тип концевой блокировки: Концевая блокировка предназначена для маскировки остаточных силанольных (Si–OH) групп и уменьшения вторичных взаимодействий. Однако колонки без концевой блокировки предлагают другую селективность, поэтому «с концевой блокировкой» не обязательно означает «лучше». Распространенные типы включают без концевой блокировки, TMS (триметилсилил) концевую блокировку и полярную концевую блокировку. Колонки обычно подвергаются концевой блокировке один или два раза, но из-за стерических препятствий полное покрытие силанолом невозможно — общие показатели маскировки обычно остаются ниже 70%.
- Встроенные полярные группы: Включение полярных функциональных групп, таких как амидные или карбаматные, может улучшить форму пика для основных соединений и обеспечить стерическую селективность. Эти колонки часто подходят для 100% водных подвижных фаз.
- Положительно заряженная поверхность: Некоторые колонки изменяют форму пиков основных соединений за счет электростатического отталкивания.
- Защита боковых цепей: Предназначены для экранирования остаточных силанольных групп и повышения стабильности.
2. Октил (C8) и Бутил (C4)
Колонки C8 обладают меньшей гидрофобностью, чем C18, но обеспечивают более равномерную плотность связывания благодаря более коротким углеродным цепям, иногда предоставляя пространственную селективность. Колонки C4 в основном используются для пептидов и белков, где сниженная гидрофобность способствует элюции.
3. Ароматические фазы
К ним относятся фенильные, пентафторфенильные (PFP) и пентабромфенильные фазы, которые вводят π–π-взаимодействия в дополнение к гидрофобным эффектам. Они превосходно разделяют ароматические изомеры, различающиеся положением заместителей в кольце. Из-за своей жесткости эти группы не могут быть напрямую связаны с диоксидом кремния и обычно соединяются через пропильные или гексильные линкеры. Их уникальная селективность также привела к разработке гибридных фаз, таких как бифенильные, перфторбифенильные и смешанные C18-ароматические стационарные фазы.
4. Колонки со смешанным режимом
Стационарные фазы смешанного типа включают заряженные функциональные группы для объединения гидрофобных и ионообменных взаимодействий. Их механизмы более сложны, а согласованность от партии к партии обычно ниже, чем у чистых фаз C18. Они лучше всего подходят для анализа небольшого количества целевых соединений. Некоторые колонки со смешанным режимом могут работать в режиме HILIC, обеспечивая большую гибкость в селективности.
Заключение и дальнейшее чтение
Мы завершили классификацию ВЭЖХ-колонок по базовому материалу и по связанной фазе. Во второй части статьи мы более подробно обсудим, как выбрать наиболее подходящую ВЭЖХ-колонку для анализа, в форме вопросов и ответов.
Следующая статья:
Выбор колонки ВЭЖХ: основа разработки метода (Часть II)
