Всегда ли меньший размер частиц в колонке приводит к лучшему разрешению при жидкостной хроматографии?

Выбор колонки играет ключевую роль в достижении оптимального разделения при разработке метода жидкостной хроматографии (ЖХ). Основные параметры колонки, включая неподвижную фазу, длину колонки, диаметр, размер частиц и размер пор, напрямую влияют на разрешение.

Принято считать, что для колонок одинаковой длины меньший размер пор обычно обеспечивает лучшее разделение. Но всегда ли это так при одинаковых условиях? Давайте рассмотрим этот вопрос на двух реальных примерах.

В этом анализе с использованием колонки Xtimate® C18 (2,1 × 100 мм, 1,8 мкм) удерживание этих пяти соединений было слабым, а ДА и МН совсем не разделялись на хроматограмме (Рис. 1). Хотя эти соединения могли быть разделены с помощью масс-спектрометрии, клинические испытания требуют хроматографического разделения для точного количественного определения.

Переход на колонку Xtimate® C18 с такими же размерами, но с бóльшим размером частиц (2,1 × 100 мм, 3 мкм) значительно улучшил удерживание и обеспечил полное разделение (Рис. 2). Этот результат демонстрирует, что увеличение размера частиц может улучшить разрешение, когда полярные аналиты проявляют слабое удерживание на колонках с меньшими частицами.

В этом случае примеси А и В анализировались с использованием колонки Ultisil® AQ-C18 (4,6 × 250 мм, 3 мкм). Несмотря на обширную оптимизацию, коэффициент разделения между этими двумя примесями оставался около 1,2, что недостаточно для соответствия нормативным требованиям (Рис. 3).

Переход на колонку Ultisil® AQ-C18 с бóльшим размером частиц (4,6 × 250 мм, 5 мкм) и небольшая корректировка скорости потока (0,8 -> 1,0) привели к значительному улучшению разделения с разрешением 1,6 (Рис. 4). Это изменение удовлетворило аналитические требования.

Уравнение Ван-Демтера позволяет понять эти результаты. Первый член уравнения, вихревая диффузия, зависит от размера частиц. Более крупные частицы создают более извилистый путь для молекул аналита, увеличивая время удерживания и улучшая разделение при определенных условиях.

В Применении 1 полярные катехоламины проявляли более слабую силу элюирования на колонке ВЭЖХ с частицами 3 мкм, что обеспечивало лучшее разрешение по сравнению с колонкой с частицами 1,8 мкм. Сниженная сила элюирования позволила увеличить удерживание и улучшить разделение.

В Применении 2 критически важными были различия в оптимальных скоростях потока между колонками. Оптимальная скорость потока колонки 5 мкм, составляющая 1 мл/мин, была достижима с помощью обычных систем ВЭЖХ, тогда как колонка 3 мкм требовала более высокой скорости потока (1,67 мл/мин), превышающей пределы давления системы. Следовательно, колонка 3 мкм работала значительно ниже своей оптимальной скорости потока, что ухудшало разрешение. Колонка 5 мкм, работающая при оптимальной скорости потока, превзошла колонку 3 мкм по разрешению.

Эти примеры показывают, что размер частиц сам по себе не определяет разрешение. При возникновении проблем с разделением попробуйте поэкспериментировать как с бóльшими, так и с меньшими размерами частиц, и вы сможете получить неожиданные преимущества.