Всегда ли меньший размер частиц в колонке приводит к лучшему разрешению при жидкостной хроматографии?

Выбор колонки играет ключевую роль в достижении оптимального разделения при разработке метода жидкостной хроматографии (ЖХ). Ключевые параметры колонки, включая неподвижную фазу, длину колонки, диаметр, размер частиц и размер пор, напрямую влияют на разрешение.

Считается, что для колонок одинаковой длины меньший размер пор, как правило, обеспечивает лучшее разделение. Но всегда ли это верно при одинаковых условиях? Давайте рассмотрим этот вопрос на двух реальных примерах.

В данном анализе с использованием колонки Xtimate® C18 (2,1 × 100 мм, 1,8 мкм) удерживание этих пяти соединений было слабым, а DA и MN вообще не разделялись на хроматограмме (рис. 1). Хотя эти соединения можно было бы разделить масс-спектрометрией, для точного количественного определения клинических испытаний требуется хроматографическое разделение.

Переход на колонку Xtimate® C18 тех же размеров, но с более крупным размером частиц (2,1 × 100 мм, 3 мкм) значительно улучшил удерживание и обеспечил полное разделение (рис. 2). Этот результат демонстрирует, что увеличение размера частиц может улучшить разрешение в случаях, когда полярные аналиты слабо удерживаются на колонках с более мелкими частицами.

В данном случае примеси A и B анализировались с использованием колонки Ultisil® AQ-C18 (4,6 × 250 мм, 3 мкм) . Несмотря на тщательную оптимизацию, коэффициент разделения между этими двумя примесями оставался около 1,2, что недостаточно для соответствия нормативным требованиям (рис. 3).

Переход на колонку Ultisil® AQ-C18 с более крупным размером частиц (4,6 × 250 мм, 5 мкм) и небольшая корректировка скорости потока (0,8 -> 1,0) привели к значительному улучшению разделения с разрешением 1,6 (рис. 4). Это изменение удовлетворило аналитическим требованиям.

Уравнение Ван-Деемтера позволяет понять эти результаты. Первый член уравнения, турбулентная диффузия , зависит от размера частиц. Более крупные частицы создают более извилистый путь для молекул аналита, увеличивая время удерживания и улучшая разделение при определённых условиях.

В случае применения 1 полярные катехоламины продемонстрировали более слабую элюирующую способность на колонке УВЭЖХ с размером частиц 3 мкм, что обеспечило лучшее разрешение по сравнению с колонкой с размером частиц 1,8 мкм. Сниженная элюирующая способность обеспечила более длительное удерживание и более эффективное разделение.

Для приложения 2 различия в оптимальной скорости потока между колонками имели решающее значение. Оптимальная скорость потока для колонки 5 мкм, равная 1 мл/мин, была достижима с помощью обычных систем ВЭЖХ, в то время как для колонки 3 мкм требовалась более высокая скорость потока (1,67 мл/мин), что превышало пределы давления системы. Следовательно, колонка 3 мкм работала со скоростью потока значительно ниже оптимальной, что ухудшало разрешение. Колонка 5 мкм, работающая с оптимальной скоростью потока, превзошла колонку 3 мкм по разрешению.

Эти примеры иллюстрируют, что размер частиц сам по себе не определяет разрешение. При возникновении проблем с разделением попробуйте поэкспериментировать с частицами как большего, так и меньшего размера , и это может дать неожиданные результаты.