Контроль качества на начальном этапе производства олигонуклеотидов: анализ чистоты фосфорамидитных мономеров на колонках Welch
Введение
Олигонуклеотидные терапевтические препараты — это короткие синтетические цепи ДНК или РНК. Благодаря таким преимуществам, как высокая специфичность, выраженная активность и длительное действие, олигонуклеотидные лекарства привлекают большое внимание для лечения редких заболеваний, генетических нарушений, хронических болезней и других патологий.
Синтез олигонуклеотидных препаратов основан на использовании высокочистых фосфорамидитных мономеров, поскольку примеси фосфорамидитов могут переходить на последующие стадии синтеза и влиять на качество конечного лекарственного продукта.
В данной заметке по применению мы оценили две гибридные кремнезёмные колонки для HPLC — Advanchrom C18 и Xtimate C18 — для анализа чистоты фосфорамидитных мономеров.
Твердофазный синтез олигонуклеотидных лекарственных препаратов
В настоящее время большинство олигонуклеотидных препаратов получают методом твердофазного синтеза с использованием фосфорамидитных мономеров в качестве строительных блоков. В ходе синтеза фосфорамидиты последовательно включаются в растущую цепь олигонуклеотида при повторяющихся циклах деблокирования, связывания, окисления и кэпирования; традиционно синтез ведётся от 3'-конца к 5'-концу.
Каждый фосфорамидит содержит защищённый нуклеозид; защитные группы, например диметокситритил (DMT), служат для регулирования реакционной способности функциональных групп во время синтеза. Также могут быть введены дополнительные модификации основания или сахарного остатка для повышения стабильности и устойчивости к нуклеазам.
Поскольку примеси, связанные с фосфорамидитами, могут передаваться через несколько циклов синтеза и в итоге влиять на профиль примесей готового олигонуклеотида, строгий контроль чистоты фосфорамидитов является обязательным условием производства олигонуклеотидных препаратов.
Анализ чистоты фосфорамидитных мономеров на колонках Welch
В данной заметке по применению компания Welch Materials оценила две гибридные кремнезёмные колонки для HPLC — Advanchrom C18 и Xtimate C18 — с широким диапазоном устойчивости к pH от 1,0 до 12,5 для анализа чистоты фосфорамидитных мономеров.
Обе колонки показали отличные результаты: высокую эффективность и разрешающую способность. Получены значения чистоты 98,19 % и 98,12 %, разрешения 3,73 и 4,33, число теоретических тарелок ≥ 62 000.
Хроматографические условия
- Колонка: Advanchrom C18, Xtimate C18 (4,6×250 мм, 5 мкм)
- Подвижная фаза: А) 10 ммоль/л гидрокарбонат аммония (NH₄HCO₃), pH 9,0; Б) Ацетонитрил
- Скорость потока: 1,0 мл/мин
- Длина волны детектора: 237 нм
- Температура колонки: 25 °C
- Объём инъекции: 10 мкл
- Образец: DMT-dA(Bz) Phosphoramidite (1 мг/мл)
- Разбавитель: Ацетонитрил
- Градиентный режим:
Time (min) A (%) B (%) 0 35 65 20 10 90 25 10 90 25.1 35 65 40 35 65
| # | Ret. Time (min) | Cont. (%) | Plates (USP) | Tailing (USP) | Res. (USP) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 15.715 | 52.92 | 56308 | 0.93 | / |
| 2 | 16.895 | 45.27 | 62892 | 0.93 | 4.33 |
| # | Ret. Time (min) | Cont. (%) | Plates (USP) | Tailing (USP) | Res. (USP) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 16.150 | 52.90 | 56626 | 0.94 | / |
| 2 | 17.187 | 45.22 | 62750 | 0.94 | 3.73 |
Почему наблюдаются два основных пика
На обеих хроматограммах видны два пика фосфорамидита. Оба пика соответствуют целевому фосфорамидитному мономеру. Дело в том, что в данном мономере атом фосфора связан с 3′-O-дезоксиаденозином, диизопропиламиногруппой и β-цианоэтоксигруппой, и обладает неподелённой электронной парой. В совокупности это формирует хиральный центр на атоме фосфора с R- и S-конфигурациями. Поскольку в остатках дезоксирибозы и азотистого основания уже есть фиксированные хиральные центры, молекула образует два диастереомера. У этих диастереомеров разное время удерживания в HPLC, поэтому на хроматограмме наблюдаются два основных пика.
Заключение
Фосфорамидитные мономеры являются важнейшим сырьём для синтеза олигонуклеотидов, поэтому достоверный анализ чистоты необходим для контроля качества на самых ранних этапах производства.
В данном применении колонки Advanchrom C18 и Xtimate C18 показали отличные хроматографические характеристики при анализе фосфорамидитов: высокое разрешение, высокую эффективность колонки и надёжное определение чистоты.
