Понимание столбцов C18: советы по активации, обслуживанию и использованию
Введение
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является неотъемлемой частью различных областей, включая фармацевтическую диагностику, безопасность пищевых продуктов, химическую инженерию, экологический мониторинг, биомедицину, судебно-медицинский анализ и энергетические исследования.
В основе хроматографических методов лежит ВЭЖХ-колонка, где выбор неподвижной фазы значительно влияет на результаты анализа.
Для обеспечения разнообразных анализов образцов инженеры разработали ряд связанных фаз, таких как C18, C8, фенил, амино, хиральные неподвижные фазы, фазы для гель-проникающей и ионообменной хроматографии.
Среди них колонка C18 выделяется как наиболее широко используемая. Правильное использование и обслуживание колонок C18 критически важны для оптимальной работы.
Активация колонок C18
Активация перед использованием необходима, если колонки оказались высохшими. Причины высыхания колонок варьируются от ослабления торцевых крышек до потери растворителя для хранения. Активация включает смачивание колонки соответствующим растворителем для хранения при низкой скорости потока.
Для новых колонок чистота растворителей для хранения может значительно различаться у разных производителей, что приводит к увеличению шума и дрейфу базовой линии во время анализов. Чтобы минимизировать эти эффекты, крайне важно заменить любой растворитель для хранения перед первым использованием. Различные причины, такие как ослабление торцевых крышек, также могут привести к испарению растворителя и высыханию колонки во время транспортировки и хранения.
Активация новых колонок обычно длится от 1 до 4 часов в соответствии с инструкциями соответствующего производителя. Если форма пика остается ненормальной после короткой активации, продлите активацию до одной ночи при скорости потока 0,2–0,3 мл/мин, используя указанный в инструкции растворитель.
Для использованных колонок активация также требуется, если они не использовались более месяца, особенно если они были подключены к системе более недели.
Ключевые аспекты активации колонок:
- Для новых или долго хранившихся колонок избегайте активации при стандартных скоростях потока обнаружения. Начните с низкой скорости потока, чтобы предотвратить повреждение упаковочного материала.
- Дайте колонкам, которые хранились в холодильнике, достичь комнатной температуры перед активацией, чтобы предотвратить тепловой шок. Кроме того, системы при высокой температуре должны сначала достичь комнатной температуры, прежде чем колонки можно будет подключить.
- Если пики становятся аномальными во время работы, тщательно замените существующий растворитель переходной подвижной фазой перед применением активирующих реагентов.
- При работе с подвижными фазами, содержащими буферные соли, убедитесь, что они полностью заменены фазой с низким содержанием органических растворителей перед активацией.
Лучшие практики использования колонок C18
Для обеспечения долговечности и эффективности колонок C18 следуйте этим рекомендациям:
- Используйте органические растворители класса ВЭЖХ и воду высокой чистоты. Все добавки также должны быть класса ВЭЖХ или аналитического класса.
- Фильтруйте подвижные фазы с использованием мембраны с порами 0,45 мкм или менее перед использованием. Выбирайте фильтры и мембраны, соответствующие растворителям. Например, используйте органические мембраны для органических растворителей и избегайте водных фильтров, которые могут растворяться в органических фазах.
- В идеале, готовьте подвижные фазы для использования в течение 24 часов, чтобы предотвратить микробное загрязнение.
- Перед использованием подвижных фаз, содержащих буферную соль (например, фосфат), сначала переключитесь на 10% метанол (или аналогичную переходную фазу) для замены высокоорганической фазы хранения. Аналогично, после использования замените фазу с буферной солью переходными фазами, а затем промойте фазой с высоким содержанием органических растворителей.
- Перед использованием подвижных фаз, нерастворимых в воде (например, дихлорметан), сначала переключитесь на растворитель, который растворяется в обеих фазах (изопропанол в приведенном выше примере).
- Предотвращайте резкие перепады температуры. Подключите колонку и дайте подвижной фазе циркулировать, прежде чем постепенно повышать температуру, и наоборот.
Регенерация колонок C18
Во время рутинных анализов, особенно сложных растительных образцов, на колонке могут адсорбироваться загрязнители, что приводит к увеличению обратного давления и снижению эффективности разделения. Помимо использования защитных колонок, регенерация может восстановить производительность колонки.
Для колонок, загрязненных сложными образцами, измените направление потока (не рекомендуется, если pH подвижной фазы превышает 7) и промойте:
- 10% органическим растворителем для удаления буферных солей
- Чистым ацетонитрилом при 1 мл/мин в течение 30 минут
- Изопропанолом при 0,2 мл/мин в течение не менее 4 часов (идеально – в течение ночи)
- Наконец, промойте чистым ацетонитрилом при 1 мл/мин еще в течение 30 минут.
Для колонок, загрязненных биологическими образцами или пораженных микробным ростом, промойте в течение ночи медленным потоком смеси ацетонитрил-вода-ТФУ (50-50-0,1).
Соблюдая эти правила, пользователи могут лучше обеспечить эффективную работу колонок ВЭЖХ и поддержание их производительности с течением времени, что приводит к более надежным и воспроизводимым результатам в аналитических приложениях.