Понимание столбцов C18: советы по активации, обслуживанию и использованию
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является неотъемлемой частью различных областей, включая фармацевтическую диагностику, безопасность пищевых продуктов, химическую технологию, мониторинг окружающей среды, биомедицину, судебную экспертизу и энергетические исследования.
В основе хроматографических методов лежит колонка ВЭЖХ , в которой выбор неподвижной фазы существенно влияет на результаты анализа.
Для проведения разнообразных анализов образцов инженеры разработали ряд связанных фаз, таких как C18, C8, фенил, амино, хиральные неподвижные фазы, фазы гель-фильтрации и ионообменные фазы.
Среди них наиболее широко используется колонка C18 . Поэтому правильное использование и обслуживание колонок C18 имеют решающее значение для их оптимальной работы.
Активация колонок C18
Предварительная активация необходима в случае высыхания колонок. Причины высыхания колонок могут быть разными: от ослабления торцевых крышек до потери растворителя для хранения. Активация заключается в смачивании колонки соответствующим растворителем для хранения при низкой скорости потока.
Чистота растворителей для хранения новых колонок может значительно различаться у разных производителей, что приводит к повышению уровня шума и дрейфу базовой линии во время анализа. Чтобы минимизировать эти эффекты, крайне важно заменить растворитель перед первым использованием. Различные причины, такие как ослабление торцевых крышек, также могут привести к испарению растворителя и высыханию колонки во время транспортировки и хранения.
Активация новых колонок обычно занимает от 1 до 4 часов в соответствии с инструкциями производителя. Если форма пиков остаётся ненормальной после короткой активации, продлите активацию до ночи при скорости потока 0,2–0,3 мл/мин, используя растворитель, указанный в инструкции.
Для бывших в употреблении колонок активация также необходима, если они не использовались более месяца, особенно если оставались подключенными к системе более недели.
Основные соображения при активации столбцов :
- Для новых или долго хранившихся колонок избегайте активации при стандартных скоростях потока детектирования. Начните с низкой скорости потока, чтобы предотвратить повреждение насадки.
- Дайте охлаждённым колонкам достичь комнатной температуры перед активацией, чтобы предотвратить тепловой шок. Более того, системы, работающие при высокой температуре, должны сначала достичь комнатной температуры, прежде чем можно будет подключать колонки.
- Если во время анализа пики становятся ненормальными, полностью замените существующий растворитель переходной подвижной фазой перед применением активирующих реагентов.
- При работе с подвижными фазами, содержащими буферные соли, перед активацией убедитесь, что они полностью заменены низкоорганической фазой.
Рекомендации по использованию столбца C18
Чтобы обеспечить долговечность и эффективность колонок C18, следуйте следующим рекомендациям:
- Используйте органические растворители и воду высокой чистоты, предназначенные для ВЭЖХ. Все добавки также должны быть класса «чистота для ВЭЖХ» или аналитического класса.
- Перед использованием отфильтруйте подвижные фазы через мембрану с размером пор 0,45 мкм или меньше. Выбирайте фильтры и мембраны, соответствующие растворителям. Например, используйте органические мембраны для органических растворителей и избегайте водных фильтров, которые могут растворяться в органических фазах.
- В идеале подвижные фазы следует подготовить к использованию в течение 24 часов, чтобы предотвратить микробное загрязнение.
- Перед использованием подвижных фаз, содержащих буферную соль (например, фосфат), сначала переведите фазу с высоким содержанием органических веществ в 10% метанол (или аналогичную переходную фазу). Аналогичным образом, после использования замените буферную солевую фазу переходными фазами, а затем промойте фазой с высоким содержанием органических веществ.
- Перед использованием подвижных фаз, нерастворимых в воде (например, дихлорметана), сначала выполните переход с использованием растворителя, растворимого в обеих фазах (изопропанол в приведенном выше примере).
- Избегайте резких колебаний температуры. Подсоедините колонку и дайте подвижной фазе циркулировать, прежде чем постепенно повышать температуру, и наоборот.
Регенерация колонок С18
Во время рутинных анализов, особенно при работе со сложными образцами трав, загрязняющие вещества могут адсорбироваться на колонке, что приводит к повышению противодавления и снижению эффективности разделения. Помимо использования защитных колонок, регенерация может восстановить их производительность.
Для колонок, загрязненных сложными образцами, измените направление потока в колонке (не рекомендуется, если pH подвижной фазы превышает 7) и промойте:
- 10% органический растворитель для удаления буферных солей
- Чистый ацетонитрил со скоростью 1 мл/мин в течение 30 минут
- Изопропанол со скоростью 0,2 мл/мин в течение как минимум 4 часов (в идеале — на ночь)
- Наконец, промывайте чистым ацетонитрилом со скоростью 1 мл/мин в течение еще 30 минут.
Для колонок, загрязненных биологическими образцами или затронутых ростом микроорганизмов, промывайте в течение ночи низкоскоростной смесью ацетонитрила, воды и ТФУ (50-50-0,1).
Придерживаясь этих правил, пользователи могут быть уверены в том, что их колонки ВЭЖХ работают эффективно и сохраняют свои характеристики с течением времени, что приводит к получению более надежных и воспроизводимых результатов в аналитических приложениях.