[Readers Insight] Взаимосвязь между свойствами колонки и интеграцией пиков

Эта статья написана штатным автором Welch Chromatography Mound. Содержание статьи отражает исключительно точку зрения автора.

Несколько недель назад мне задали интересный вопрос: Можете ли вы написать статью о взаимосвязи между колонками и интегрированием пиков?

На первый взгляд, я понятия не имел, так как эти два понятия кажутся несвязанными: одно — это часть разделительного оборудования, а другое — математическая процедура, выполняемая на хроматограмме. С чего мне начать?

Но когда я углубился в это, обнаружилась ясная и практически важная связь.

Интегрирование — это, по сути, расчет площади хроматографического пика: сигнал детектора над базовой линией отслеживается, и замкнутая область вычисляется программным обеспечением. Поскольку площадь представляет собой общую массу аналита, проходящего через детектор, интегрированная площадь должна (теоретически) оставаться неизменной независимо от того, является ли пик острым и высоким или широким и низким, при условии, что концентрация остается постоянной.

Однако эмпирические наблюдения часто противоречат этой теоретической постоянности. При сравнении хроматограмм одного и того же аналита в различных условиях удерживания часто наблюдаются расхождения в интегрированных площадях пиков, элюирующихся в разное время удерживания.

Рассмотрим сценарий, когда мы держим колонку, детектор (DAD в этом примере) и концентрацию аналита постоянными и только изменяем состав подвижной фазы для задержки удерживания. Очевидно, что пик будет расширен. Теоретически, поскольку концентрация не меняется, площадь пика должна оставаться постоянной, а высота пика должна падать. Но на практике высота пика может быть даже выше, а площадь пика становится больше (см. хроматограмму ниже). Подобные явления также существуют, когда меняются только используемые колонки.

Механизм, лежащий в основе указанного расхождения, заключается в скорости, с которой зона аналита проходит через проточную кювету детектора.

Детектор работает с конечной частотой дискретизации, накладывая временные ограничения (время отклика детектора, частота дискретизации АЦП, постоянные времени и онлайн-фильтрация или сглаживание). Эти параметры определяют, насколько точно регистрируется переходный сигнал.

Когда аналит элюируется с высокой линейной скоростью, продолжительность его пребывания в проточной кювете минимизируется, что может привести к уменьшению количества точек данных, собранных по всему пику. Если частота дискретизации недостаточна для захвата быстрого потока молекул на высоких скоростях, то полученное интегрирование может страдать от недостаточной дискретизации, что приводит к небольшой потере записанной площади. 

И наоборот, колонка, обеспечивающая большее удерживание, приводит к тому, что аналит проходит через детектор с более низкой скоростью. Это увеличенное время пребывания позволяет детектору выполнять больше циклов дискретизации для той же массы аналита, что потенциально приводит к более полному и точному представлению профиля пика.

Подобно тому, как высокоскоростная камера снимает быстро движущийся объект, точность конечного изображения — или, в данном случае, интегрированной площади — неразрывно связана со скоростью объекта относительно скорости захвата устройства.