Анализ агрегации биоаналога пембролизумаба с высоким разрешением методом SEC-ВЭЖХ с использованием колонок Welch Xtimate™ SEC
Аннотация
Пембролизумаб — гуманизированное моноклональное антитело IgG4/каппа, широко используемое в иммуноонкологии. SEC-ВЭЖХ является критически важным аналитическим инструментом для оценки агрегации и фрагментации моноклональных антител. В данной статье описывается надежный метод SEC-ВЭЖХ с использованием колонки Welch Xtimate SEC-300, демонстрирующий эффективное разделение мономера, ВМВ-агрегатов и НМВ-фрагментов.
Введение
Структурная целостность моноклональных антител напрямую связана с их безопасностью и эффективностью. Разработка биоаналогов пембролизумаба требует чувствительных методов для мониторинга агрегации. SEC-ВЭЖХ разделяет молекулы на основе гидродинамического объема в неденатурирующих условиях, что делает ее предпочтительным методом для анализа гетерогенности по размеру.
| Структурная целостность | Разработка биоаналогов | Метод SEC-ВЭЖХ |
| Прямая связь с безопасностью и эффективностью моноклональных антител | Требует чувствительных методов для мониторинга агрегации | Предпочтительный метод анализа гетерогенности по размеру в неденатурирующих условиях |
Подготовка образцов
Образцы активного вещества биоаналога пембролизумаба были подготовлены путем разведения исходного раствора подвижной фазой SEC до конечной концентрации 2,0 мг/мл. Образцы осторожно перемешивали инверсией, чтобы избежать агрегации, вызванной сдвигом. Подготовленные образцы переносили в виалы для ВЭЖХ и хранили при 10 ± 2 °C в автосамплере перед анализом. Фильтрацию избегали, чтобы предотвратить потенциальную потерю высокомолекулярных агрегатов.
Стандарт пригодности системы: В качестве стандарта пригодности системы использовали бычий сывороточный альбумин (БСА). Раствор БСА с концентрацией 1,0 мг/мл готовили в воде Milli-Q и вводили для проверки производительности колонки, разрешения и воспроизводимости.
Реагенты и химикаты
| Реагент/материал | Класс |
| Моногидрат дигидрофосфата натрия | Аналитический класс |
| Динатрий гидрофосфат (безводный) | Аналитический класс |
| Хлорид натрия | Аналитический класс |
| Ацетонитрил (ACN) | ВЭЖХ класс |
| Вода Milli-Q | ВЭЖХ класс |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Эталонный стандарт |
| Виалы и крышки для ВЭЖХ | Сертифицировано |
Хроматографические условия
| Параметр | Условие |
| Колонка | Welch Xtimate SEC-300 (4,6 × 300 мм, 3 мкм) |
| Подвижная фаза | 100 мМ фосфатный буфер + 300 мМ NaCl : ACN (80:20) |
| Скорость потока | 0,2 мл/мин |
| Температура колонки | 30 ± 2 °C |
| Объем инжекции | 25 мкл |
| Детектирование | 214 нм (мониторинг при 280 нм) |
| Время анализа | 45 мин |
Результаты и обсуждение
Колонка Welch Xtimate SEC-300 обеспечила отличное разрешение между мономером пембролизумаба и высокомолекулярными агрегатами. Пик мономера (~146–147 кДа) был острым и симметричным, что указывает на минимальные вторичные взаимодействия.
Ключевые наблюдения:
- Преимущественно мономерные виды с ожидаемым временем удерживания
- Отдельные ВМВ-виды с более ранним временем элюции
- НМВ-виды с более поздним временем удерживания
- Гетерогенная смесь в промежуточных образцах процесса
Примечание: Промежуточные образцы процесса содержат гетерогенную смесь мономерного пембролизумаба вместе с ВМВ-агрегатами и НМВ-фрагментами.
Заключение
Разработанный метод SEC-ВЭЖХ с использованием колонки Welch Xtimate™ SEC-300 продемонстрировал надежную работу и четкое разделение мономера, высокомолекулярных агрегатов и низкомолекулярных видов. Таким образом, метод хорошо подходит для рутинного контроля качества и для сравнительной оценки биоаналогов пембролизумаба.