Выбор размера пор ВЭЖХ-колонок и его влияние на результаты анализа
Введение
В ВЭЖХ размер пор колонки относится к среднему размеру пор или полостей в частицах наполнителя, варьирующемуся от 100 до 300 Å. В пористых упаковочных материалах более 95% взаимодействий между неподвижной фазой и целевыми аналитами происходят внутри этих частиц (то есть внутри пор). Поэтому размер пор является одним из важнейших параметров хроматографического упаковочного материала.
Как значение размера пор, так и его распределение в упаковочном материале играют критическую роль в хроматографическом разделении и очистке:
- Наполнители с большими порами увеличивают время пребывания макромолекулярных растворенных веществ на поверхности неподвижной фазы, обеспечивая адекватное разделение и улучшая форму пика. Поэтому наполнители с большими порами подходят для разделения макромолекулярных соединений или молекул с большими гидродинамическими объемами.
- Наполнители с малыми порами обеспечивают большую удельную поверхность, поддерживая большую загрузочную способность образца и удерживая малые органические соединения. Поэтому наполнители с малыми порами подходят для широкого спектра малых органических молекул до полимеров.
Выбор размера пор на основе молекулярной массы
Выбор размера пор колонки определяется молекулярной массой.
Молекула аналита может проникнуть внутрь пористой частицы наполнителя только тогда, когда ее молекулярный диаметр меньше диаметра поры; более того, чтобы минимизировать влияние на аналитические характеристики, диаметр поры должен быть как минимум в три раза больше диаметра молекулы. В целом, выбранный размер пор колонки часто более чем в четыре раза превышает гидродинамический диаметр образца.
Поэтому, теоретически, соединения с молекулярной массой ниже 10 000 должны анализироваться с использованием колонки 120 Å; соединения с молекулярной массой более 10 000 и менее 200 000 должны анализироваться с использованием колонки 300 Å; а соединения с молекулярной массой более 200 000 требуют гель-колонки.
На практике выбор несколько отличается. Если молекулярная масса соединения ниже 2000, выбирается колонка с размером пор от 80 Å до 180 Å; если выше, выбирается колонка 300 Å. Полностью пористые колонки 300 Å особенно подходят для разделения белков и пептидов.
Что происходит, когда размер пор слишком мал?
Когда молекулярный размер аналита слишком велик для пор упаковочного материала, эффективность разделения может значительно ухудшиться.
Например, при использовании 120 Å наполнителя для разделения крупной молекулы разрешение может быть низким, поскольку хорошее разрешение на обратнофазной колонке требует, чтобы аналит мог проникать в поры частиц наполнителя и взаимодействовать со связанными цепями на внутренних поверхностях пор. Если аналит слишком велик для эффективного проникновения в поры, эффективное взаимодействие между аналитом и неподвижной фазой уменьшается, что приводит к плохому удержанию, низкому разрешению и негативному влиянию на форму пика.
Пример применения: Лактоферрин
Клиент Welch Materials использует колонку Xtimate C4, 120 Å для анализа лактоферрина, получая следующую хроматограмму. Легко наблюдаются сильное расщепление пиков и неудовлетворительная форма пиков.
Поскольку лактоферрин имеет молекулярную массу от 75 000 до 80 000, аналитики перешли на колонку Ultisil XB-C4, 300 Å, получив следующую хроматограмму. Форма пика значительно улучшилась.
Чтобы помочь будущим клиентам, колонки Xtimate C4, 300 Å были разработаны позднее в начале 2024 года, следуя этому примеру применения. По сравнению с Ultisil XB-C4, 300 Å, Xtimate C4, 300 Å имеет диапазон pH 1,0–12,5, предлагая отличную стабильность для применений с высоким pH. Xtimate C4 также лучше подходит для детекторов MS и ELSD.
Заключение
Размер пор является важным параметром, который может существенно влиять на результаты ВЭЖХ-анализа. Выбор подходящего размера пор в соответствии с молекулярной массой анализируемого вещества имеет решающее значение для достижения оптимального хроматографического разрешения и симметрии пиков.