Выявление неучтенных факторов, лежащих в основе аномальных исходных показателей
Оглавление
Введение
В жидкостной хроматографии большое внимание уделяется точности, часто оцениваемой с помощью относительного стандартного отклонения (ОСО), но одной из наиболее коварных и часто недооцениваемых проблем является возникновение аномальных базовых линий .
Стабильная, ровная базовая линия является основой надежного количественного и качественного анализа; без нее даже хорошо разделенные пики могут быть неверно интерпретированы, а пределы обнаружения или количественного определения могут стать бессмысленными.
В этой статье определяются ключевые концепции, связанные с исходными данными, изучаются распространенные и скрытые причины шума и дрейфа исходных данных, предлагаются целевые средства для устранения характерных нарушений исходных данных, а в заключение приводится пример из реальной практики, иллюстрирующий систематический поиск и устранение неисправностей.
Ключевые понятия и определения
В хроматографическом анализе хроматограмма — это графическое представление отклика детектора во времени, также известное как хроматографическая кривая элюирования. Пики на этой кривой соответствуют элюированию аналита.
В данном контексте базовая линия относится к выходному сигналу детектора, когда через систему протекает только подвижная фаза, без ввода образца. Стабильная базовая линия в идеале должна представлять собой ровную горизонтальную линию. Отклонения от этого идеала могут проявляться в виде шума, дрейфа или нерегулярных флуктуаций.
- Базовый шум : непрерывные или периодические электрические колебания или «микропики», наблюдаемые, когда образец не вводился, возникающие из-за случайных возмущений.
- Дрейф базовой линии : постепенное направленное изменение уровня базовой линии с течением времени, наложенное на идеальную горизонтальную линию. Подробное руководство по различению шума базовой линии и дрейфа можно найти здесь.
- Соотношение сигнал/шум (S/N) : отношение высоты пика аналита (сигнала) к уровню шума базовой линии. Этот показатель характеризует чувствительность метода и имеет решающее значение при определении предела обнаружения (LOD) и предела количественного определения (LOQ).
Основные источники шума и дрейфа базовой линии
-
Неполная дегазация подвижной фазы
Растворённые в растворителях газы могут выделяться в виде пузырьков в насосе, трубке, колонке или детекторе, вызывая колебания давления и шум. Недостаточное смешивание компонентов подвижной фазы также может приводить к образованию микропузырьков. -
Загрязненная подвижная фаза, колонка или детектор
Примеси твердых частиц или химических веществ приводят к нестабильным сигналам и непредсказуемому дрейфу. Даже следовые количества загрязняющих веществ могут вызывать значительные искажения базовой линии высокочувствительных детекторов. -
Утечки в системе
Утечка в любом месте ниже по потоку от насоса приводит к проникновению воздуха или выходу жидкости, что приводит к нестабильности давления и сигнала. -
Недостаточная интенсивность источника света детектора
В детекторах УФ-ВИД старение или смещение лампы может привести к снижению светопропускания, что приведет к появлению шумов или дрейфующей базовой линии. -
Неправильный выбор длины волны или настройки сбора данных
Выбор длины волны детектирования, близкой к границе поглощения УФ-излучения растворителя, или установка слишком высокой частоты сбора данных могут привести к усилению шума.
Категоризированные базовые отклонения и стратегии их устранения
A. Обычная, пилообразная базовая линия
Симптомы : на базовой линии наблюдаются периодические пики в виде зазубренных краев; линия давления выглядит грубой с большими колебаниями.
Вероятные причины и способы устранения :
- Воздух в головке насоса : Полностью дегазируйте и повторно залейте насос.
- Неисправные обратные клапаны : очистите ультразвуком или замените штоки клапанов.
- Изношенные поршневые уплотнения или штоки : очистите или замените уплотнения и поршневые штоки.
- Недостаточное смешивание : установите смеситель большего объема для тщательного смешивания растворителей.
- Недостаточное противодавление на детекторе : убедитесь, что длина выходной трубки достаточна для обеспечения противодавления и предотвращения образования пузырьков.
- Помехи от статического заряда : проверьте правильность заземления компонентов системы.
Б. Выраженная пульсация
Симптомы : Базовый уровень демонстрирует значительные периодические колебания, напоминающие пульсацию насоса.
Причина и способ устранения : Обычно это связано с повреждением уплотнений штока поршня; выполните очистку или замену узла штока или уплотнений.
C. Хаотическая базовая линия при отсутствии инъекции
Симптомы : Исходные данные нестабильны и не имеют четкой закономерности даже без введения образца.
Причина и способ устранения : Загрязнение системы; выполните полную промывку системы с использованием высокочистых растворителей и, при необходимости, разберите и очистите или замените загрязненные компоненты.
D. Дрейф базовой линии
Симптомы : Прогрессирующее повышение или понижение базовой линии в течение бега.
Причины и способы устранения :
- Изменения температуры : Многие детекторы, особенно детекторы дифференциального показателя преломления (RID), детекторы проводимости (CD) и высокочувствительные УФ-детекторы, чувствительны к температуре. Контролируйте температуру термостата колонки, температуру подвижной фазы, температуру проточной ячейки и температуру окружающей среды в лаборатории. Если дрейф сохраняется, рассмотрите возможность использования устройства для теплообмена после колонки.
- Неоднородность или загрязнение подвижной фазы : неоднородный состав растворителя или наличие примесей часто приводят к неравномерному дрейфу. Используйте растворители класса ВЭЖХ и соли/добавки высокой чистоты.
- Загрязнение проточной ячейки детектора или образование пузырьков воздуха : очистите проточную ячейку сильным полярным растворителем, например метанолом, и убедитесь, что пузырьки удалены.
- Перетянуты выходные трубки детектора : избыточное противодавление может привести к разрушению проточной ячейки, что приведет к повышению базового уровня. Ослабьте фитинги с рекомендуемым моментом затяжки.
- Недостаточное уравновешивание колонки : перед вводом образца следуйте рекомендованному производителем протоколу уравновешивания.
- Сильно удерживаемые аналиты : сильно удерживаемые соединения могут расширяться и сужаться, проявляясь в виде восходящей базовой линии; оптимизируйте выбор градиента или неподвижной фазы для смягчения этого эффекта.
Пример: систематическое устранение неполадок хаотичной базовой линии
Пользователь сообщил о неустойчивом, бессистемном поведении базовой линии во время рутинного анализа. Обсуждение показало, что подвижная фаза готовилась ежедневно, и прибор работал нормально, сместив фокус на насос.
Шаг первый (оценка насоса)
Мониторинг колебаний давления в системе данных выявил значительные колебания. После повторной заливки и удаления воздуха из насоса стабильность давления улучшилась, а формы пиков стали более чёткими, однако колебания базового уровня сохранились.
Шаг второй (проверка столбцов)
Пользователь заменил колонку и выполнил тщательное уравновешивание. Формы пиков вернулись к норме, но базовый шум сохранился.
Шаг третий (очистка проточной ячейки детектора)
Предполагая загрязнение проточной ячейки, система была промыта в течение двух часов сверхчистой водой, а затем ещё два часа метанолом. Тестирование после промывки показало стабильную, ровную базовую линию и нормальные пиковые характеристики, что подтвердило, что основной причиной было загрязнение ячейки детектора.
Заключение
Аномальные базовые линии нарушают целостность данных и могут привести к неверной интерпретации результатов хроматографии. Понимая специфические закономерности отклонений базовой линии — будь то пилообразный шум, выраженная пульсация, случайный хаос или медленный дрейф, — аналитики могут применять целенаправленные корректирующие меры.
Системный подход, начинающийся с проверки насоса, за которым следует оценка подвижной фазы и колонки, и завершающийся обслуживанием детектора, гарантирует, что даже незначительные или упущенные из виду факторы будут обнаружены и устранены.
Поддержание строгой подготовки растворителя, надлежащего заземления системы и строгого контроля температуры дополнительно гарантирует стабильность исходной линии, тем самым повышая как чувствительность, так и воспроизводимость анализов ВЭЖХ.