Раскрытие дела: причины низкого показателя LC RSD
Содержание
Введение
Жидкостная хроматография (ЖХ) является незаменимым инструментом в аналитических лабораториях, предлагая высокую точность в количественном анализе. Однако при столкновении с неожиданными отклонениями в воспроизводимости пиковой площади устранение неисправностей может быть сложным процессом.
В этой статье рассматривается реальный случай, связанный с плохим относительным стандартным отклонением (RSD) в системе ВЭЖХ, и предлагается систематический подход к диагностике и устранению таких проблем.
Случай: Проблемное относительное стандартное отклонение (RSD)
Доктор Джонсон, химик-аналитик из отдела технической поддержки Welch Materials, получил запрос от лаборатории по анализу пищевых продуктов. При количественном определении сахаров с использованием системы ВЭЖХ Welch, оснащенной рефрактометрическим детектором (РИД), несмотря на стабильное время удерживания, лаборатория наблюдала, что RSD пиковой площади превышает допустимый предел метода 0,3%, достигая неудовлетворительных 0,8%.
| Хроматографические условия | |
|---|---|
| Детектор | РИД |
| Подвижная фаза | 100% чистая вода |
| Скорость потока | 1 мл/мин |
| Колонка | Сахарная колонка |
Поиск и устранение неисправностей
Понимая, что изменчивость пиковой площади может быть вызвана несколькими факторами, доктор Джонсон методично исследовал потенциальные источники ошибок.
1. Проверка герметичности системы
Первым шагом было обеспечение целостности системы ЖХ. Доктор Джонсон осмотрел все соединения трубок и наблюдал за системой в рабочем состоянии, чтобы обнаружить любые утечки. Поскольку утечек жидкости не было обнаружено и скорость потока насоса была стабильной, утечка системы была исключена как причина.
2. Оценка автосамплера
Учитывая, что неточность инжекции является частой причиной изменчивости пиковой площади, автосамплер был следующим компонентом под пристальным вниманием. Были выполнены следующие ключевые проверки:
-
Наличие пузырьков воздуха в шприце: Пузырьки не наблюдались, что исключает непостоянство объема инжекции как возможный фактор.
- Эффективность цикла промывки: Во время цикла промывки наблюдалась утечка жидкости из порта инжекции — аномалия, указывающая на неправильное уплотнение в месте инжекции.
-
Выравнивание глубины инжекции: Программная проверка глубины подтвердила, что игла проникает в правильное положение.
- Герметичность инжекционного порта: При более тщательном осмотре было обнаружено, что септа изношена, и она была незамедлительно заменена.
После этих настроек повторный анализ показал небольшое улучшение RSD, снизив его до 0,7824%, но все еще не достигая требуемого порога.
Более тщательная проверка выявила, что мелкие фрагменты септы флакона накопились в инжекционном порту, мешая забору образца. Эти препятствия также были удалены.
Скрытый виновник: Неправильная эквилибрация
Хотя изношенная септа инжекционного порта и фрагменты септы виалы способствуют увеличению RSD, фактической причиной проблемы является недостаточная эквилибрация колонки. После того как системе было разрешено эквилибрироваться в течение 12 часов в соответствии с руководством по колонке, окончательный тестовый запуск продемонстрировал значительное улучшение — RSD теперь составляло удовлетворительные 0,2047%.
Выводы: Почему RSD пиковой площади может быть высоким
Проблемы с воспроизводимостью пиковой площади могут возникать из различных источников. Вот основные факторы, которые следует учитывать:
1. Проблемы, связанные с прибором
- Неисправности пробоотборника:
Пробоотборник всегда проверяется в первую очередь. Обычно пузырьки, образующиеся при измерении объема образца, являются основной причиной ошибки. Для разных типов пробоотборников проблемы и решения различаются.
При использовании ручного пробоотборника убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в шприце; для пробоотборников с фиксированным объемом убедитесь, что воздух не попадает в поток. Одна из особенностей, которую следует отметить, заключается в том, что когда септа, окружающая инжекционный порт флакона с образцом, герметизирована, при аспирации большого объема образца создается отрицательное давление. Это может привести к попаданию пузырьков воздуха в поток, что приводит к непостоянным объемам образца между инжекциями. Использование предварительно проколотых септ может уменьшить эту проблему.
Для автосамплеров вот некоторые распространенные проблемы и их решения:
| Проблема | Решение |
|---|---|
| Износ ротора или уплотнения иглы | Замените ротор или уплотнения иглы. |
| Погнутая или засоренная инжекционная игла | Ультразвуковая очистка иглы (убедитесь, что кончик иглы не касается дна флакона); замените иглу, если очистка неэффективна. |
| Инжекционная игла не находится в положении "Ввод" перед отбором пробы | Установите иглу в положение "Ввод" перед началом инжекции пробы. |
| Пузырьки в шприце инжектора | Выполните команду заполнения шприца перед инжекциями для удаления любых пузырьков воздуха. Может потребоваться ручная дегазация. |
| Слишком высокая скорость инжекции | Уменьшите скорость аспирации до 3-5 секунд для правильного отбора пробы. |
| Протекающий шприц или изношенный инжекционный клапан | Замените шприц или инжекционный клапан. |
- Проблемы с детектором:
Плохое заземление детектора может привести к колебаниям пиковой площади. Степень интеграции зависит от соотношения сигнал/шум. Колебания скорости потока, приводящие к изменениям пиковой площади, редки, но могут произойти.
Если состав подвижной фазы меняется, это может повлиять на время удерживания или привести к появлению фантомных или отрицательных пиков, что будет мешать интеграции. Чтобы избежать таких проблем, растворите образец в подвижной фазе или используйте колонку-ловушку для фантомных пиков, чтобы улавливать нежелательные пики.
2. Проблемы, связанные с образцами
- Перенос образца: Если концентрация аналита значительно варьируется, а площадь пика не стабилизируется после нескольких инъекций, это может быть результатом переноса образца. Убедитесь, что пробоотборник тщательно очищается после каждой инъекции, а растворитель, используемый для очистки, смешивается с образцом.
- Колебания температуры: Хотя эффект обычно минимален, изменения температуры все же могут влиять на площадь пика. Например, когда образец вынимается из холодильника и помещается в лоток автосамплера, он постепенно нагревается до температуры окружающей среды. По мере расширения растворителя объем, введенный первоначально, может отличаться от последующих инъекций. Чтобы предотвратить это, дайте образцу стабилизироваться при комнатной температуре перед инъекцией.
-
Проблемы, специфичные для образца: Например, некоторые белки в обращенно-фазовой хроматографии могут не полностью элюироваться во время начальной фазы градиента, но могут элюироваться во время последующих холостых градиентов. В таких случаях между анализами следует проводить холостой градиент.
Кроме того, некоторые образцы могут необратимо адсорбироваться на активных участках колонки. При использовании совершенно новой колонки площади пиков могут медленно увеличиваться после повторных инъекций по мере адсорбции образца на этих участках. Как только активные участки будут насыщены, будут получены стабильные площади пиков. Чтобы уменьшить специфическую адсорбцию, используйте колонку с алмазоподобным углеродом или введите другие образцы для насыщения активных участков.
3. Скорость потока и производительность насоса
Случайные колебания скорости потока также могут вызывать изменения площади пика, обычно из-за таких проблем, как неисправности клапанов или воздух в головке насоса. Эти проблемы обычно сопровождаются изменением времени удерживания и могут быть диагностированы путем контроля противодавления.
Еще одной потенциальной причиной является утечка на стороне высокого давления системы. Большинство современных насосов для жидкостной хроматографии оснащены датчиками утечки, что облегчает выявление этой проблемы.
4. Ошибки обработки и интеграции данных
Проблемы с интеграцией труднее решить. Хотя значительные изменения в интеграции пиков могут быть обнаружены визуально, более тонкие проблемы сложнее выявить. При отношении сигнал/шум 100 или ниже, хвостатые пики могут вызывать заметные ошибки интеграции. Шум базовой линии ограничивает точность интеграции, а такие проблемы, как фронтирование или хвост пика, могут усугублять проблему.
Чтобы решить эту проблему, попробуйте настроить параметры интеграции и повторно обработать данные, чтобы увидеть, можно ли исправить проблему.
Заключение
Данное тематическое исследование подчеркивает важность структурированного подхода к устранению проблем с воспроизводимостью площади пика в ВЭЖХ-анализе. Систематически исключая потенциальные источники ошибок, д-р Джонсон успешно выявил и исправил проблему, достигнув требуемой аналитической точности.
Понимание ключевых факторов в приборах, образцах, насосах и обработке данных может помочь хроматографистам поддерживать надежные и воспроизводимые результаты в своих лабораториях.