Оптимизация градиента в жидкостной хроматографии

При работе со сложными составами образцов одна хроматографическая система может испытывать трудности с достижением идеального разделения — либо требуя чрезмерного времени, либо давая низкое разрешение. В таких случаях градиентное элюирование может значительно сократить время анализа и повысить эффективность разделения.

В этой статье мы представляем тематическое исследование тонкой настройки градиента, чтобы продемонстрировать его замечательное влияние на хроматографические характеристики.

1. Консистентность прибора: Разрабатывайте метод на приборе, который будет доступен для долгосрочных испытаний.
2. Осведомленность о производительности системы: Понимайте характеристики производительности прибора, чтобы предотвратить проблемы с воспроизводимостью после изменений системы.
3. Ключевые параметры системы: Два основных системных параметра, которые следует учитывать, это объем задержки градиента и пропорциональная точность. Эти параметры могут быть определены с помощью одного конкретного эксперимента:
   • Используйте сверхчистую воду в качестве подвижной фазы A и 0,1% ацетона в воде в качестве фазы B;
   • Добавьте УФ-детектор после фазы B;
   • Настройте многоступенчатый градиент, где фаза B увеличивается от 0% до 100% с шагом 5%, каждый шаг длится примерно 5 минут, используя типичную скорость потока 1 мл/мин;
   • Запустите градиентную программу через T-образное соединение и запишите хроматограмму.
   • Разница между запрограммированным временем градиента и фактическим временем перехода градиента определяет время задержки градиента. Высота плато может быть использована для оценки точности состава подвижной фазы — незначительные изменения объема смешивания могут вызвать небольшое размытие.
4. Разработка метода на основе характеристик системы: После установления производительности системы метод может быть соответствующим образом адаптирован. Самая большая проблема при переносе градиентного метода — это различия в объеме задержки градиента между приборами:
   • Если новый прибор имеет больший объем задержки, чем исходный, на котором был разработан метод, добавьте изократическую задержку в начале программы для компенсации.
   • Если новый прибор имеет меньший объем задержки, добавьте задержку градиента при переносе метода.
   • В редких случаях, когда пропорциональные неточности возникают в середине градиента, скорректируйте градиентную программу для устранения различий.
5. Начальное уравновешивание подвижной фазы: Если колонка была неполностью уравновешена начальной подвижной фазой, быстрые градиентные переходы приведут к тому, что первая инъекция будет отличаться от последующих. Перенос методов между системами с разными объемами задержки градиента вызовет различные эффекты.