Оптимизация градиента в жидкостной хроматографии

При работе со сложными по составу образцами одна хроматографическая система может испытывать трудности с достижением идеального разделения, требуя либо слишком много времени, либо давая низкое разрешение. В таких случаях градиентное элюирование может значительно сократить время анализа и повысить эффективность разделения.

В этой статье мы представляем пример точной настройки градиента, чтобы продемонстрировать ее значительное влияние на эффективность хроматографии.

1. Постоянство инструмента : Разработайте метод на инструменте, который будет доступен для долгосрочных испытаний.
2. Осведомленность о производительности системы : изучите характеристики производительности прибора, чтобы предотвратить проблемы с воспроизводимостью после внесения изменений в систему.
3. Ключевые параметры системы : Два основных параметра системы, которые следует учитывать, — это объём задержки градиента и пропорциональная точность . Эти параметры можно определить с помощью одного конкретного эксперимента:
   • Используйте сверхчистую воду в качестве подвижной фазы А и 0,1% раствор ацетона в воде в качестве фазы В;
   • Добавить УФ-детектор после фазы B;
   • Настройте многоступенчатый градиент, в котором фаза B увеличивается от 0% до 100% с шагом 5%, каждый шаг в течение приблизительно 5 минут, используя типичную скорость потока 1 мл/мин;
   • Пропустите градиентную программу через Т-образное соединение и запишите хроматограмму.
   • Разница между запрограммированным временем градиента и фактическим временем перехода градиента определяет время задержки градиента. Высоты плато можно использовать для оценки точности состава подвижной фазы — незначительные изменения объёма смешивания могут привести к лёгкому размытию.
4. Разработка метода на основе характеристик системы : после того, как производительность системы будет установлена, метод можно адаптировать соответствующим образом. Самая большая проблема при переносе градиентного метода — это разница в объёме задержки градиента между приборами:
   • Если новый инструмент имеет больший объем задержки, чем исходный, на основе которого был разработан метод, добавьте изократическую задержку в начале программы для компенсации.
   • Если новый инструмент имеет меньший объем задержки, добавьте градиентную задержку при переносе метода.
   • В редких случаях, когда в середине градиента возникают пропорциональные неточности, скорректируйте программу градиента, чтобы устранить различия.
5. Начальное равновесие подвижной фазы : если колонка не была полностью уравновешена с исходной подвижной фазой, быстрые градиентные переходы приведут к тому, что первый ввод пробы будет отличаться от последующих. Перенос методов между системами с разными объёмами задержки градиента приведёт к разным результатам.