Аналитический метод для 18 аминокислот

1. Сверхчистая вода (≥18 МОм·см)
2. Ацетонитрил (для ВЭЖХ)
3. Тригидрат ацетата натрия (аналитическая чистота)
4. Ледяная уксусная кислота (чда)
5. Реагенты для дериватизации A и B (хранить в холодильнике; использовать надлежащие меры защиты, так как эти реагенты опасны)
6. Гексан (для ВЭЖХ)
7. Раствор соляной кислоты 0,1 моль/л: добавьте 9,0 мл концентрированной HCl в деионизированную воду и разбавьте до 1000 мл.
8. Раствор внутреннего стандарта норлейцина: Взвесьте приблизительно 10 мг норлейцина, растворите в 10 мл 0,1 моль/л раствора HCl и тщательно перемешайте.

Подвижная фаза А:

• Состав: 0,1 моль/л раствора ацетата натрия (pH 6,5): ацетонитрил = 93,0:7,0
• Приготовление: Растворите 13,6 г тригидрата ацетата натрия в 1000 мл воды. Доведите pH до 6,5, используя ледяную уксусную кислоту или раствор гидроксида натрия. Отмерьте 930 мл этого раствора и смешайте с 70 мл ацетонитрила. Профильтруйте через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Подвижная фаза B:

• Состав: Вода: ацетонитрил = 20,0:80,0
• Приготовление: смешать 200 мл воды с 800 мл ацетонитрила. Профильтровать через мембрану с размером пор 0,22 мкм.

1. Разбавьте дериватизирующие реагенты А и В разбавителем до 1/5 от их исходной концентрации.
2. Пипеткой отберите 160 мкл стандартного раствора в пробирку. Добавьте по 100 мкл разбавленных реагентов A и B. Тщательно перемешайте и оставьте реакцию при комнатной температуре на 60 минут. Затем добавьте 400 мкл гексана, закройте пробирку и встряхивайте 5–10 секунд. Оставьте при комнатной температуре для разделения слоев.
3. Возьмите 200 мкл нижнего слоя и смешайте с 800 мкл воды. 200 мкл смеси смешайте с ещё 800 мкл воды. Для анализа профильтруйте через органическую мембрану с размером пор 0,22 мкм.
4. Для образца выполните ту же процедуру, что и для стандарта. Отрегулируйте объём разбавления в зависимости от содержания аминокислот.

Примечание: Если для предварительной обработки образца используется кислотный гидролиз, убедитесь, что кислота полностью испарилась перед дериватизацией. Для завершения реакции дериватизации требуется щелочная среда, поскольку избыток кислоты может её нейтрализовать.

1. Установите температуру колонки 40 °C, а скорость потока — 1,0 мл/мин.
2. Дегазируйте каналы A и B раствором ацетонитрила : воды в соотношении 20:80 (если канал B не содержит буферного раствора, дегазация этим раствором не требуется). Затем дегазируйте канал B подвижной фазой B.
3. Промойте систему смесью ацетонитрила:воды = 20:80 (канал А) в течение 20 минут для предотвращения осаждения буферной соли.
4. Используйте подвижную фазу А для дегазации канала А, затем проведите базовую линию в течение 30 минут с подвижной фазой А для уравновешивания колонки.
5. Выполните пустой градиентный прогон.
6. Ввести образцы для анализа.
7. После анализа:
   • Замените подвижную фазу А на смесь ацетонитрила и воды в соотношении 20:80 и введите пробы воды для очистки автосамплера. Выполните градиентное элюирование.
   • Промывайте колонку 90% ацетонитрилом не менее 40 минут.