Аналитический метод для 18 аминокислот
Оглавление
I. Приборы и реагенты
Приборы:
- Аналитические весы (точность: 0,1 мг)
- Термостатируемая водяная баня
- Мерные колбы
- Пробирки (1,5 × 15 см или 1,5 × 10 см)
- Микрошприц (5 мкл или 10 мкл)
- Регулируемый микропипетка (1000 мкл и 200 мкл) с несколькими наконечниками
- Вортекс-миксер
- Система ВЭЖХ с специализированной колонкой для анализа аминокислот (4,6 × 250 мм, 5 мкм)
Реагенты:
- Сверхчистая вода (≥18 МОм·см)
- Ацетонитрил (ВЭЖХ-класс)
- Натрия ацетат тригидрат (аналитический класс)
- Ледяная уксусная кислота (аналитический класс)
- Реагенты для дериватизации A и B (хранить в холодильнике; использовать надлежащие средства защиты, так как эти реагенты опасны)
- Гексан (ВЭЖХ-класс)
- 0,1 моль/л раствор соляной кислоты: добавить 9,0 мл концентрированной HCl к деионизированной воде и разбавить до 1000 мл.
- Внутренний стандартный раствор норлейцина: отвесить приблизительно 10 мг норлейцина, растворить в 10 мл 0,1 моль/л раствора HCl и тщательно перемешать.
II. Приготовление подвижных фаз
Подвижная фаза A:
- Состав: 0,1 моль/л раствор ацетата натрия (pH 6,5): ацетонитрил = 93,0:7,0
- Приготовление: Растворить 13,6 г тригидрата ацетата натрия в 1000 мл воды. Довести pH до 6,5 с помощью ледяной уксусной кислоты или раствора гидроксида натрия. Отмерить 930 мл этого раствора и смешать с 70 мл ацетонитрила. Отфильтровать через мембрану 0,22 мкм.
Подвижная фаза B:
- Состав: Вода: ацетонитрил = 20,0:80,0
- Приготовление: Смешать 200 мл воды с 800 мл ацетонитрила. Отфильтровать через мембрану 0,22 мкм.
III. Реакция дериватизации
1. Концентрации стандартных растворов
Название |
М.М. |
С (мкмоль/мл) |
Название |
М.М. |
С (мкмоль/мл) |
Аспарагиновая кислота |
133.10 |
2.50 |
Цистин |
240.30 |
1.25 |
Глутаминовая кислота |
147.13 |
2.50 |
NH4Cl |
53.49 |
2.50 |
Серин |
105.09 |
2.50 |
Тирозин |
181.19 |
2.50 |
Глицин |
75.067 |
2.50 |
Валин |
117.15 |
2.50 |
Гистидин |
155.15 |
2.50 |
Метионин |
149.21 |
2.50 |
Аргинин |
174.20 |
2.50 |
Изолейцин |
131.17 |
2.50 |
Треонин |
119.12 |
2.50 |
Лейцин |
131.17 |
2.50 |
Аланин |
89.093 |
2.50 |
Фенилаланин |
165.19 |
2.50 |
Пролин |
115.13 |
2.50 |
Лизин |
146.19 |
2.50 |
Название |
М.М. |
С (мкмоль/мл) |
Аспарагиновая кислота |
133.10 |
2.50 |
Глутаминовая кислота |
147.13 |
2.50 |
Серин |
105.09 |
2.50 |
Глицин |
75.067 |
2.50 |
Гистидин |
155.15 |
2.50 |
Аргинин |
174.20 |
2.50 |
Треонин |
119.12 |
2.50 |
Аланин |
89.093 |
2.50 |
Пролин |
115.13 |
2.50 |
Цистин |
240.30 |
1.25 |
NH4Cl |
53.49 |
2.50 |
Тирозин |
181.19 |
2.50 |
Валин |
117.15 |
2.50 |
Метионин |
149.21 |
2.50 |
Изолейцин |
131.17 |
2.50 |
Лейцин |
131.17 |
2.50 |
Фенилаланин |
165.19 |
2.50 |
Лизин |
146.19 |
2.50 |
2. Приготовление растворов проб
Точно отмерить или взвесить соответствующее количество образца и приготовить раствор нужной концентрации для использования.
3. Этапы дериватизации
- Разбавить реагенты для дериватизации A и B разбавителем до 1/5 их первоначальных концентраций.
- Пипеткой внести 160 мкл стандартного раствора в пробирку. Добавить по 100 мкл разбавленных реагентов A и B. Хорошо перемешать и оставить для реакции при комнатной температуре на 60 минут. Затем добавить 400 мкл гексана, закрыть пробирку и встряхивать в течение 5–10 секунд. Оставить при комнатной температуре для разделения слоев.
- Взять 200 мкл нижнего слоя и смешать с 800 мкл воды. Взять 200 мкл этой смеси и смешать с еще 800 мкл воды. Отфильтровать через органическую мембрану 0,22 мкм для анализа.
- Для образца следовать той же процедуре, что и для стандарта. Объем разбавления корректировать в зависимости от содержания аминокислот.
Примечание: Если для предварительной обработки образца используется кислотный гидролиз, убедитесь, что кислота полностью испарилась перед дериватизацией. Дериватизация требует щелочной среды для полного протекания реакции, так как избыточная кислотность может нейтрализовать реакцию.
IV. Хроматографические условия
Колонка |
|||
Подвижная фаза |
|
||
Градиентная программа |
Время (мин) |
Фаза A |
Фаза B |
0,01 |
100,0% |
0,0% |
|
11 |
93,0% |
7,0% |
|
13,9 |
88,0% |
12,0% |
|
14 |
85,0% |
15,0% |
|
29 |
66,0% |
34,0% |
|
32 |
30,0% |
70,0% |
|
35 |
0,0% |
100,0% |
|
42 |
0,0% |
100,0% |
|
45 |
100,0% |
0,0% |
|
60 |
100,0% |
0,0% |
|
Скорость потока |
1,0 мл/мин |
||
Температура |
40 °C |
||
Длина волны |
254 нм |
||
V. Процедуры и меры предосторожности
1. Процедуры:
- Промыть колонку и систему
- Применить градиентную программу, чтобы убедиться в отсутствии пиков помех
- Ввести стандартные растворы с использованием линейной регрессии для определения градуировочной кривой
- Ввести образцы и рассчитать их содержание на основе градуировочной кривой.
2. Меры предосторожности:
- Колонка для ВЭЖХ должна храниться в растворе ацетонитрила и воды 80:20 (по объему), запечатанной с обеих сторон.
- Если система не будет использоваться в течение длительного времени, все растворы должны быть заменены чистой водой, а затем промыты 80% ацетонитрилом. Колонка должна быть снята, промыта ацетонитрилом и запечатана пробками для хранения.
- Перед каждым использованием необходимо сменить подвижную фазу.
- Скорость потока должна быть установлена на 0,1 мл/мин и постепенно увеличиваться до 1,0 мл/мин. Давление должно поддерживаться ниже 20 МПа, а изменение давления не должно превышать 0,5 МПа.
- Если для обнаружения используются УФ-детекторы, длины волн для разных веществ могут отличаться. Для большинства производных используется 254 нм.
- Дериватизационные реагенты необходимо хранить в холодильнике и использовать с надлежащими мерами защиты. Избегать контакта с кожей.
- Перед использованием фильтровать все растворы и подвижные фазы через мембрану 0,22 мкм.
- Обработка образцов должна проводиться в лабораторных условиях, чтобы избежать загрязнения.
- Реакция дериватизации требует строгих условий, таких как температура, время, pH и концентрация, для обеспечения эффективности реакции и точного количественного определения.
- Для анализа должны использоваться высокочистые стандартные образцы и реагенты.
Объем инъекции
10 мкл
1 |
Аспарагиновая кислота |
8 |
Аланин |
15 |
Изолейцин |
2 |
Глутаминовая кислота |
9 |
Пролин |
16 |
Лейцин |
3 |
Серин |
10 |
NH4Cl |
17 |
Норлейцин |
4 |
Глицин |
11 |
Тирозин |
18 |
Фенилаланин |
5 |
Гистидин |
12 |
Валин |
19 |
Лизин |
6 |
Аргинин |
13 |
Метионин |
||
7 |
Треонин |
14 |
Цистин |
1 |
Аспарагиновая кислота |
11 |
Тирозин |
2 |
Глутаминовая кислота |
12 |
Валин |
3 |
Серин |
13 |
Метионин |
4 |
Глицин |
14 |
Цистин |
5 |
Гистидин |
15 |
Изолейцин |
6 |
Аргинин |
16 |
Лейцин |
7 |
Треонин |
17 |
Норлейцин |
8 |
Аланин |
18 |
Фенилаланин |
9 |
Пролин |
19 |
Лизин |
10 |
NH4Cl |
V. Процедуры и меры предосторожности
1. Процедуры:
- Установите температуру колонки на 40 °C и скорость потока на 1,0 мл/мин.
- Дегазируйте каналы A и B, используя раствор ацетонитрила: вода = 20:80 (если канал B не содержит буфера, дегазация этим раствором не требуется). Затем дегазируйте канал B подвижной фазой B.
- Промойте систему ацетонитрилом: водой = 20:80 (канал A) в течение 20 минут, чтобы предотвратить осаждение буферной соли.
- Используйте подвижную фазу А для дегазации канала А, затем проведите базовую линию в течение 30 минут с подвижной фазой А для уравновешивания колонки.
- Выполните холостой градиентный запуск.
- Впрысните образцы для анализа.
- После анализа:
- Замените подвижную фазу А на ацетонитрил: вода = 20:80 и впрысните образцы воды для очистки автосамплера. Выполните градиентное элюирование.
- Промойте колонку 90% ацетонитрилом в течение не менее 40 минут.
2. Меры предосторожности:
- Впрыскивайте стандартный раствор перед раствором образца.
- Готовьте буферные растворы ежедневно.
- Остерегайтесь осаждения буферной соли.