Колонка с аминогруппами (NH2): как сохранить высокую производительность?
Введение
Аминоколонки, также известные как NH2-колонки, широко используются как в нормально-фазовой, так и в обращенно-фазовой хроматографии благодаря их уникальной селективности и универсальности. Однако их отличительные свойства также создают проблемы, такие как снижение эффективности колонки, увеличение противодавления, смещение времени удерживания и аномальные помехи пиков. Эти проблемы возникают из-за отличительных свойств аминоколонок, в частности их подверженности гидролизу.
Понимание лучших практик использования и обслуживания является ключом к продлению срока службы колонок и обеспечению надежных результатов.
Понимание аминоколонок
Связанная фаза аминоколонки состоит из аминопропильных функциональных групп. В отличие от обычных колонок с обращенной фазой, таких как C18, C8 или C4, аминогруппы более подвержены гидролизу, что приводит к сокращению срока службы. Правильные стратегии обращения и обслуживания могут смягчить эти проблемы и продлить срок службы колонки.
Аминоколонки могут функционировать как в нормально-фазовой, так и в обращенно-фазовой хроматографии. Однако, поскольку растворители в этих режимах не являются взаимно растворимыми, при переключении между ними следует использовать подходящий переходный растворитель (например, изопропанол). Ниже приведены основные рекомендации по оптимизации работы аминоколонок в обоих режимах.
Режим обращенной фазы
В режиме обращенной фазы аминоколонки особенно чувствительны к pH и содержанию воды в подвижной фазе. Гидролиз ускоряется в кислых условиях (pH < 3) или при высоком содержании воды. Чтобы смягчить это, идеальный диапазон pH для подвижной фазы должен поддерживаться между 3 и 7.
После анализа колонку следует промыть и правильно хранить. Если подвижная фаза не содержит кислоты или соли, достаточно промыть ее 100% ацетонитрилом. Однако, если присутствуют соли, сначала промойте колонку 60% ацетонитрилом в воде в течение 40 минут, затем переключитесь на 100% ацетонитрил, снова промойте перед хранением.
В случаях высокого противодавления, аномальных форм пиков или снижения эффективности колонки промывайте колонку последовательно со стандартной скоростью потока, используя следующие растворители: 100% ацетонитрил → 100% метанол → 100% изопропанол → 100% ацетонитрил, каждый в течение 30 минут. Уменьшайте скорость потока во время промывки изопропанолом из-за его более высокой вязкости.
Режим нормальной фазы
Очистка после анализа в нормально-фазовом режиме начинается с промывки 100% гексаном, после чего следует хранение в смеси гексана/изопропанола 90/10.
В нормально-фазовой хроматографии содержание воды как в стационарной, так и в подвижной фазах играет решающую роль в стабильности времени удерживания и эффективности разделения. Колебания времени удерживания часто объясняются изменениями содержания воды. Для решения этой проблемы колонку можно обезвожить с помощью раствора 2,5% диметоксипропана и 2,5% ледяной уксусной кислоты в гексане, промывая 30 объемами колонки.
Для приготовления подвижной фазы рекомендуется использовать подход «полунасыщения». Он включает смешивание безводного неполярного растворителя с водонасыщенной частью, перемешивание в течение часа и удаление избытка воды перед объединением двух фаз. Это обеспечивает постоянное содержание воды и улучшает воспроизводимость.
Если производительность колонки снижается, последовательность промывки 100% изопропанолом → 100% метанолом → 100% изопропанолом (каждый в течение 40 минут) может восстановить функциональность. Опять же, скорость потока должна быть отрегулирована для изопропанола из-за его вязкости.
Особые рекомендации для колонок для анализа лактозы
Xtimate® Lactose-NH2 — это специализированная аминоколонка, разработанная для анализа лактозы, протоколы обслуживания которой отличаются. Эти колонки следует промывать и хранить в 100% ацетонитриле. Если возникают проблемы с производительностью, последовательно промывайте 100% метанолом → 100% ацетонитрилом → 100% изопропанолом → 100% ацетонитрилом, каждый раз в течение 3 часов.
Для обеспечения оптимальной производительности колонок, специфичных для лактозы, необходимы дополнительные меры предосторожности.
- Подвижная фаза должна быть тщательно перемешана, отфильтрована под вакуумом и дегазирована ультразвуком в течение 10 минут.
- Избегайте встроенных фильтров и используйте один канал подвижной фазы для предотвращения колебаний.
- Поддерживайте объем впрыска 10 мкл, так как большие объемы увеличивают уширение пиков. Переход на петлю объемом 10 мкл минимизирует внеколоночный мертвый объем.
- Кроме того, поскольку рефрактометрические детекторы (РИД) чувствительны к колебаниям температуры, отсек колонки следует изолировать сухими материалами, такими как вата или полотенца, для стабилизации базовой линии.
Заключение
Полярность аминопропильной функциональной группы и ее подверженность гидролизу делают аминоколонки более сложными в обслуживании, чем обычные фазы. Однако, придерживаясь надлежащих рекомендаций по использованию — таких как контроль pH, управление содержанием воды и внедрение строгих протоколов очистки — пользователи могут значительно продлить срок службы этих колонок и поддерживать их высокую производительность. Будь то в обращенно-фазовых, нормально-фазовых или специализированных применениях, понимание и удовлетворение уникальных потребностей аминоколонок является ключом к достижению надежных и воспроизводимых результатов.