Колонка с аминогруппами (NH2): как сохранить высокую производительность?
Введение
Аминоколонки , также известные как NH2-колонки , широко используются как в нормально-фазовой, так и в обращенно-фазовой хроматографии благодаря своей уникальной селективности и универсальности. Однако их особые свойства также создают проблемы, такие как снижение эффективности колонки, повышенное противодавление, сдвиг времени удерживания и аномальные интерференции пиков. Эти проблемы обусловлены особыми свойствами аминоколонок, в частности, их склонностью к гидролизу.
Понимание передовых методов использования и обслуживания имеет ключевое значение для продления срока службы колонки и обеспечения надежных результатов.
Понимание колонок Amino
Связанная фаза аминоколонки состоит из аминопропильных функциональных групп. В отличие от обычных обращённо-фазовых колонок, таких как C18, C8 или C4, аминогруппы более подвержены гидролизу, что приводит к сокращению срока службы. Правильные стратегии обращения и обслуживания могут снизить эти проблемы и продлить срок службы колонки.
Колонки с аминогруппами могут работать как в нормально-фазовой, так и в обращенно-фазовой хроматографии. Однако, поскольку растворители в этих режимах не являются взаиморастворимыми, при переключении между ними следует использовать подходящий переходный растворитель (например, изопропанол). Ниже приведены основные рекомендации по оптимизации производительности колонок с аминогруппами в обоих режимах.
Режим обращенной фазы
В режиме обращённой фазы колонки с аминогруппами особенно чувствительны к pH и содержанию воды в подвижной фазе. Гидролиз ускоряется в кислой среде (pH < 3) или при высоком содержании воды. Чтобы снизить этот эффект, оптимальный диапазон pH подвижной фазы должен составлять от 3 до 7.
После анализа колонку следует промыть и хранить надлежащим образом. Если подвижная фаза не содержит кислот или солей, достаточно промывки 100% ацетонитрилом. Однако, если присутствуют соли, сначала промойте колонку 60% раствором ацетонитрила в воде в течение 40 минут, затем переключитесь на 100% ацетонитрил и промойте ещё раз перед хранением.
В случае высокого противодавления, аномальной формы пика или снижения эффективности колонки промойте колонку последовательно со стандартной скоростью потока следующими растворителями: 100% ацетонитрил → 100% метанол → 100% изопропанол → 100% ацетонитрил, каждый по 30 минут. Уменьшите скорость потока при промывке изопропанолом из-за его более высокой вязкости.
Нормально-фазовый режим
Постанализационная очистка в нормально-фазовом режиме начинается с промывки 100% гексаном с последующим хранением в смеси гексана/изопропанола 90/10.
В нормально-фазовой хроматографии содержание воды как в неподвижной, так и в подвижной фазах играет решающую роль в стабильности времени удерживания и эффективности разделения. Колебания времени удерживания часто обусловлены колебаниями содержания воды. Для решения этой проблемы колонку можно дегидратировать, используя раствор 2,5% диметоксипропана и 2,5% ледяной уксусной кислоты в гексане, промывая его в количестве, равном 30 объёмам колонки.
Для приготовления подвижной фазы рекомендуется использовать метод «полунасыщения». Он включает смешивание безводного неполярного растворителя с насыщенной водой частью раствора, перемешивание в течение часа и удаление избытка воды перед рекомбинацией двух фаз. Это обеспечивает стабильное содержание воды и улучшает воспроизводимость.
Если производительность колонки снижается, последовательность промывок 100% изопропанолом → 100% метанолом → 100% изопропанолом (каждая по 40 минут) может восстановить её работоспособность. Расход изопропанола также следует корректировать из-за его вязкости.
Особые указания по колонкам для анализа лактозы
Xtimate® Lactose-NH2 — это специализированная колонка для анализа лактозы с аминокислотами, протоколы обслуживания которой различаются. Эти колонки следует промывать и хранить в 100% ацетонитриле. При возникновении проблем с производительностью последовательно промывайте колонку 100% метанолом → 100% ацетонитрилом → 100% изопропанолом → 100% ацетонитрилом, каждый раз в течение 3 часов.
Для обеспечения оптимальной производительности колонок, специфичных для лактозы, необходимы дополнительные меры предосторожности.
- Подвижную фазу следует тщательно перемешать, отфильтровать под вакуумом и дегазировать ультразвуком в течение 10 минут.
- Избегайте использования встроенных фильтров и используйте один канал подвижной фазы для предотвращения колебаний.
- Поддерживайте объём ввода на уровне 10 мкл, так как большие объёмы увеличивают уширение пика. Переход на петлю объёмом 10 мкл минимизирует мёртвый объём вне колонки.
- Кроме того, поскольку детекторы показателя преломления (RID) чувствительны к колебаниям температуры, отсек колонки следует изолировать сухими материалами, такими как вата или полотенца, для стабилизации базовой линии.
Заключение
Полярность аминопропильной функциональной группы и её склонность к гидролизу делают обслуживание аминоколонок более сложным, чем колонок с обычными фазами. Однако, соблюдая надлежащие правила эксплуатации, такие как контроль pH, контроль содержания воды и соблюдение строгих протоколов очистки, пользователи могут значительно продлить срок службы этих колонок и сохранить их высокую эффективность. Независимо от того, используются ли они в обращённо-фазной хроматографии, в нормально-фазной хроматографии или в специализированных приложениях, понимание и учёт уникальных особенностей аминоколонок является ключом к достижению надёжных и воспроизводимых результатов.