Часто задаваемые вопросы по Advanchrom HIC-Butyl: стабильность линкера, обработка образцов, обработка колонок…

В разделе вопросов и ответов представлены вопросы участников нашего вебинара, состоявшегося 22 мая. В нём рассматриваются основные вопросы анализа АЦП с использованием колонок Advanchrom HIC-Butyl , отражающие широкий спектр практических интересов и технических вопросов. Для большей ясности и удобства чтения все вопросы и ответы оформлены в формальном стиле.

Кроме того, некоторые ответы были расширены после вебинара, чтобы предоставить дополнительный контекст и пояснения; эти расширенные ответы отмечены красным .

Если вы еще не смотрели, вот полная запись нашего вебинара:

В1: Используется ли эта колонка для исследования рака?

A1: Он используется для анализа препаратов на основе конъюгатов антитела с лекарственным препаратом (ADC). Препараты на основе ADC разрабатываются для лечения рака.

В2: Я думаю, что для такого анализа нам следует использовать внутренний стандарт, чтобы гарантировать отсутствие диссоциации препарата от антитела.

A2: Внутренний стандарт (ВС) не предотвращает диссоциацию препарата и антитела. Тем не менее, правильно подобранный ВС (например, комплекс, меченый стабильным изотопом) может помочь отслеживать и частично корректировать диссоциацию, но только если он ведет себя аналогично фактическому комплексу.

Чтобы свести к минимуму диссоциацию, оптимизируйте условия обработки образцов (например, pH, температуру и т. д.) и рассмотрите возможность использования ортогональных методов, таких как SEC или нативная MS, для оценки стабильности комплекса.

В3: Что это за образец? Это кровь с препаратом ADC?

A3: Нет. Первоначальным образцом будет синтезированный в лаборатории АЦП, который затем будет сравниваться со стандартом этого конкретного АЦП.

В4: Если я правильно понял, вы сказали, что чрезмерное использование органической подвижной фазы может разрушить линкер между антителом и полезным грузом. Это применимо ко всем типам линкеров? Каков рекомендуемый процент органического растворителя? Максимальное содержание — 25%, как указано в вашем последнем слайде?

A4: Для цистеиновых и гистидиновых линкеров в ADC содержание органического растворителя не должно превышать 25%. Однако другие типы линкеров, такие как ферментативные и генно-инженерные, более устойчивы и выдерживают до 30% органического растворителя. Поскольку цистеиновые и гистидиновые линкеры используются чаще всего, рекомендуется ограничить содержание органического растворителя до 25%.

В5: Так ли работает терапевтический лекарственный мониторинг?

A5: Да. Упрощённо говоря, противораковые препараты действуют по принципу «замок и ключ». Антитело связывается с определённым участком раковой клетки и доставляет лекарство внутрь. Затем лекарство подавляет рост клетки и в конечном итоге убивает её.

В6: Где используются эти колонки? На фармацевтическом производстве, в научных и научно-исследовательских лабораториях — где-то ещё?

A6: Колонки HIC в первую очередь применяются для анализа белков, антител и ADC. Возможности применения в других областях пока не раскрыты.

В7: Есть ли способ определить, разложился ли линкер образца до более низкого соотношения лекарственного средства к антителу (DAR) или он остался нетронутым?

A7: Условия расщепления линкера жёсткие: например, для расщепления нерасщепляемого линкера требуется обработка лизоцимом при низком pH (4,5–5,0). Гидрохимическая ингибирующая хроматография (ГИХ) протекает в более мягких условиях, обычно в солевой фазе и при нейтральном pH около 7,0, что предотвращает расщепление линкеров.

Кроме того, существует три способа определить, сломался ли линкер:

1. Объедините методы ЖХ-МС и HIC, чтобы оценить, является ли линкер целым или поврежденным.
2. Сравните образец как со свежими (неповрежденными), так и с намеренно деградированными контрольными образцами, чтобы выявить признаки разрушения линкера.
3. Используйте несколько методов, ЖХ-МС, HIC и иммуноферментный анализ (например, ИФА и т. д.), чтобы получить полную картину целостности линкера и стабильности DAR.

В8: Поможет ли наклон градиента в разработке метода?

A8: Да, наклон градиента может быть полезен. Замедление градиента, то есть снижение скорости изменения концентрации соли в подвижной фазе, может привести к уширению пиков во время элюирования. Однако в некоторой степени это может улучшить разделение аналитов.

В9: Как следует обращаться с колонкой, чтобы минимизировать нежелательные взаимодействия?

A9: Традиционные колонки на основе силикагеля часто испытывают проблемы с адсорбцией белка. Однако в наших колонках силикагель покрыт защитным полимерным слоем, который не только защищает силикагельный субстрат, но и предотвращает неспецифическую адсорбцию.

С другой стороны, вновь изготовленные колонки могут по-прежнему содержать небольшое количество участков, способных адсорбировать белки, например, на фриттах или внутренних поверхностях трубок из нержавеющей стали.

Рекомендуется предварительно кондиционировать колонку, введя достаточное количество белка для блокирования этих участков, или пассивировать колонку ЭДТА перед использованием. Это помогает обеспечить надёжность и воспроизводимость результатов.

В10: Представите ли вы подготовительную версию этой колонки?

A10: В настоящее время препаративная версия не разрабатывается, но будет представлена ​​позднее в зависимости от потребностей рынка .