Простой, но эффективный способ разделения изомеров
Введение
При разработке методов разделения изомеров сталкивались ли вы когда-нибудь с такой ситуацией? Пологий градиент или изократическое элюирование обеспечивают лучшее разделение, чем стандартный градиент , но при небольшом увеличении соотношения органической фазы изомеры не разделяются полностью. С другой стороны, уменьшение соотношения органической фазы выше определённого значения уже не улучшает разрешение. В некоторых случаях, хотя пики кажутся полностью разделёнными, размытые формы пиков приводят к недостаточному разрешению после интегрирования.
Если одной лишь корректировки соотношения органической фазы недостаточно для достижения баланса формы пика и разрешения, означает ли это, что у нас нет других вариантов? В этой статье мы представляем простой, но эффективный способ решения этой проблемы на примере двух практических примеров.
Приложение 1
Метод 1
| Столбец | Ultisil® Phenyl-Ether (4,6×150 мм, 3 мкм) | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | Буферная соль (%) | Ацетонитрил (%) |
| 0 | 55 | 45 | |
| 45 | 40 | 60 | |
| 45.01 | 55 | 45 | |
| 60 | 55 | 45 | |
При разделении целевого компонента с использованием Ultisil® Phenyl-Ether (4,6×150 мм, 3 мкм) в условиях градиента разрешение между пиками было низким, что приводило к их слиянию. Для решения этой проблемы мы попытались замедлить градиент.
Метод 2
| Столбец | Ultisil® Phenyl-Ether (4,6×150 мм, 3 мкм) | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | Буферная соль (%) | Ацетонитрил (%) |
| 0 | 60 | 40 | |
| 40 | 47 | 53 | |
| 40.01 | 60 | 40 | |
| 50 | 60 | 40 | |
После замедления градиента разрешение между основным пиком и соседними примесями составляет 1,55 и 1,79 соответственно. Однако дальнейшая корректировка градиента не привела к дальнейшему улучшению.
В данном случае перед градиентом мы провели 20-минутную изократическую выдержку при 40% органической фазы, что позволило образцу медленнее мигрировать по колонке и улучшить разделение компонентов. Последующее градиентное элюирование облегчило их элюирование.
Метод 3
| Столбец | Ultisil® Phenyl-Ether (4,6×150 мм, 3 мкм) | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | Буферная соль (%) | Ацетонитрил (%) |
| 0 | 60 | 40 | |
| 20 | 60 | 40 | |
| 60 | 47 | 53 | |
| 60.01 | 60 | 40 | |
| 70 | 60 | 40 | |
В этих условиях разрешение между основным пиком и соседними примесями улучшилось до 1,75 и 1,84 соответственно.
Это показывает, что включение изократического сегмента с низкой концентрацией органической фазы перед градиентом (в данном примере 20 минут) позволяет образцу медленнее проходить через колонку, что улучшает разделение компонентов перед применением градиента для элюирования. Такая стратегия эффективно улучшает разрешение.
Приложение 2
При разработке метода на Ultisil® Cellu-JR (4,6×250 мм, 5 мкм) два пика продемонстрировали тенденцию к разделению, при этом изократические условия обеспечивали лучшее разрешение, чем градиентное элюирование. Однако по мере уменьшения доли органической фазы пики оставались не полностью разделенными, а их форма ухудшалась.
Метод 1
| Столбец | Ultisil® Cellu-JR (4,6×250 мм, 5 мкм) |
| Подвижная фаза | 0,1% диэтиламин/метанол = 15/85 |
В изократических условиях разрешение между двумя пиками составило 1,4.
Для улучшения разделения мы использовали 20-минутную изократическую выдержку при 70% метаноле, что позволило хиральным изомерам медленнее мигрировать по колонке для лучшего разделения. Последующий 5-минутный градиентный переход к 80% метанолу был использован для ускорения элюирования и уточнения формы пика.
Метод 2
| Столбец | Ultisil® Cellu-JR (4,6×250 мм, 5 мкм) | ||
| Скорость потока | 0,35 мл/мин | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | 0,1% Диэтиламин (%) | Метанол (%) |
| 0 | 30 | 70 | |
| 20 | 30 | 70 | |
| 25 | 20 | 80 | |
| 40 | 20 | 80 | |
| 40.01 | 30 | 70 | |
| 60 | 30 | 70 | |
При этих измененных условиях разрешение между двумя компонентами увеличилось до 1,9.
Этот случай дополнительно иллюстрирует, что добавление изократического сегмента с низкой органической фазой перед градиентом (в данном примере 20 минут) приводит к более медленной миграции хиральных изомеров внутри колонки, что улучшает разделение. Последующий градиентный переход восстанавливает скорость элюирования и форму пика. Этот подход оказывается эффективным способом улучшения разрешения.