Простой, но эффективный способ разделения изомеров
Введение
При разработке методов разделения изомеров, сталкивались ли вы когда-нибудь с такой ситуацией? Медленный градиент или изократическое элюирование обеспечивают лучшее разделение, чем стандартный градиент, но при незначительном увеличении доли органической фазы изомеры не достигают полного разделения. С другой стороны, уменьшение доли органической фазы ниже определенной точки уже не улучшает разрешение. В некоторых случаях, хотя пики кажутся полностью разделенными, широкие формы пиков приводят к неадекватному разрешению после интегрирования.
Если одна лишь корректировка доли органической фазы не может сбалансировать форму пика и разрешение, означает ли это, что у нас нет других вариантов? В этой статье мы представляем простой, но эффективный трюк для решения этой проблемы на двух примерах.
Применение 1
Метод 1
| Колонка | Ultisil® Phenyl-Ether (4.6×150 мм, 3 мкм) | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | Буферная соль (%) | Ацетонитрил (%) |
| 0 | 55 | 45 | |
| 45 | 40 | 60 | |
| 45.01 | 55 | 45 | |
| 60 | 55 | 45 | |
При разделении целевого компонента с использованием Ultisil® Phenyl-Ether (4.6×150 мм, 3 мкм) в градиентных условиях разрешение между пиками было низким, что приводило к их слиянию. Для решения этой проблемы мы попытались замедлить градиент.
Метод 2
| Колонка | Ultisil® Phenyl-Ether (4.6×150 мм, 3 мкм) | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | Буферная соль (%) | Ацетонитрил (%) |
| 0 | 60 | 40 | |
| 40 | 47 | 53 | |
| 40.01 | 60 | 40 | |
| 50 | 60 | 40 | |
После замедления градиента разрешение между основным пиком и соседними примесями составило 1.55 и 1.79 соответственно. Однако дальнейшие корректировки градиента не принесли дополнительных улучшений.
В этом случае мы ввели 20-минутную изократическую выдержку при 40% органической фазы перед градиентом, что позволило образцу медленнее мигрировать внутри колонки и улучшило разделение между компонентами. Последующее градиентное элюирование способствовало их элюированию.
Метод 3
| Колонка | Ultisil® Phenyl-Ether (4.6×150 мм, 3 мкм) | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | Буферная соль (%) | Ацетонитрил (%) |
| 0 | 60 | 40 | |
| 20 | 60 | 40 | |
| 60 | 47 | 53 | |
| 60.01 | 60 | 40 | |
| 70 | 60 | 40 | |
В этих условиях разрешение между основным пиком и соседними примесями улучшилось до 1.75 и 1.84 соответственно.
Это демонстрирует, что включение изократического сегмента с низкой долей органической фазы перед градиентом (20 минут в этом примере) позволяет образцу медленнее проходить через колонку, улучшая разделение компонентов до применения градиента для элюирования. Эта стратегия эффективно повышает разрешение.
Применение 2
При разработке метода на Ultisil® Cellu-JR (4.6×250 мм, 5 мкм) два пика показали тенденцию к разделению, причем изократические условия давали лучшее разрешение, чем градиентное элюирование. Однако по мере уменьшения доли органической фазы пики оставались неполностью разделенными, а их формы ухудшались.
Метод 1
| Колонка | Ultisil® Cellu-JR (4.6×250 мм, 5 мкм) |
| Подвижная фаза | 0.1% Диэтиламин / Метанол = 15/85 |
В изократических условиях разрешение между двумя пиками составило 1.4.
Для улучшения разделения мы ввели 20-минутную изократическую выдержку при 70% метанола, что позволило хиральным изомерам медленнее мигрировать внутри колонки для лучшего разрешения. Затем был применен 5-минутный градиентный переход до 80% метанола для ускорения элюирования и уточнения формы пиков.
Метод 2
| Колонка | Ultisil® Cellu-JR (4,6 × 250 мм, 5 мкм) | ||
| Скорость потока | 0,35 мл/мин | ||
| Программа элюирования | Время (мин) | 0,1% диэтиламина (%) | Метанол (%) |
| 0 | 30 | 70 | |
| 20 | 30 | 70 | |
| 25 | 20 | 80 | |
| 40 | 20 | 80 | |
| 40,01 | 30 | 70 | |
| 60 | 30 | 70 | |
В этих модифицированных условиях разрешение между двумя компонентами увеличилось до 1,9.
Данный случай дополнительно иллюстрирует, что добавление изократического сегмента с низкой органической фазой перед градиентом (20 минут в данном примере) замедляет миграцию хиральных изомеров внутри колонки, улучшая разделение. Последующий градиентный переход восстанавливает скорость элюирования и форму пика. Этот подход оказывается эффективным способом улучшения разрешения.