![[Readers Insight] Why Mobile Phase Alterations Can Reverse Elution Order](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/elution-order-630-1080_fa63e819-5a63-4bdd-8451-041cbce9a310_750x.jpg?v=1782971026)
[Readers Insight] Почему изменение подвижной фазы может обратить порядок элюирования
Эта статья написана штатным автором Welch's Chromatography Mound. Содержание статьи отражает исключительно точку зрения автора.
Введение
В рутинной работе ВЭЖХ самой сложной задачей часто является не плохое разрешение, а неожиданное хроматографическое поведение.
Представьте себе метод, в котором Пик А всегда элюировался раньше Пика В. Вы внесли небольшую корректировку в подвижную фазу, предназначенную для оптимизации разрешения, и теперь Пик В внезапно элюируется раньше Пика А. Вы подозревали, что это была неисправность прибора, ошибка инжекции или неправильно маркированный образец, но хроматограмма не подтвердила ни одну из этих причин.
Основная причина на самом деле кроется в химии подвижной фазы. Незначительные изменения в подвижной фазе принципиально изменяют взаимодействие между аналитами и как стационарной, так и подвижной фазами.
Обратное изменение порядка элюирования обычно происходит из-за трех основных факторов: изменения pH, различий в селективности органического модификатора и специфических характеристик выбранной буферной соли.
Изменения pH
Если образец содержит ионизируемые соединения (слабые кислоты или основания), изменение pH подвижной фазы меняет степень их ионизации. Поскольку ионизированные и нейтральные молекулы ведут себя по-разному в хроматографии, даже небольшая корректировка pH может значительно изменить удерживание.
Например, в RPLC с колонкой C18 нейтральные, неионизированные молекулы, будучи предпочитаемыми стационарной фазой, имеют более сильное удерживание, чем заряженные, ионизированные частицы.
Для слабокислых соединений:
- Низкий pH: Ионизация подавляется, заставляя соединение переходить в нейтральное молекулярное состояние. Это увеличивает гидрофобные взаимодействия со стационарной фазой, что приводит к увеличению времени удерживания.
- Высокий pH: По мере увеличения pH выше pKa соединения, аналит депротонируется в отрицательно заряженный ион. Это значительно увеличивает его полярность, заставляя его элюироваться гораздо раньше, иногда вблизи объема вытеснения.
Для слабощелочных соединений:
- Низкий pH: Основание протонируется и становится положительно заряженным, проявляя слабое удерживание на гидрофобной стационарной фазе.
- Высокий pH: Основание переходит в нейтральную молекулярную форму, усиливая гидрофобное удерживание и увеличивая время удерживания, потенциально меняя порядок элюирования с нейтральными соединениями.
Если образец содержит как ионизируемое соединение, так и нейтральное соединение (например, бензол), которое не зависит от pH, изменение pH подвижной фазы приведет к динамическому изменению времени удерживания ионизируемого аналита, в то время как нейтральный аналит остается неподвижным. Этот дифференциальный сдвиг часто приводит к полному инвертированию пиков.
Органический модификатор
Хотя метанол и ацетонитрил часто сравниваются исключительно по их элюирующей силе, замена одного другим изменяет селективность растворителя подвижной фазы. Согласно треугольнику селективности растворителей Снайдера, эти растворители демонстрируют различные химические взаимодействия:
- Метанол: Действует как донор протонов и легко участвует в образовании водородных связей с аналитами, содержащими акцепторы водородных связей (такие как гидроксильные группы).
- Ацетонитрил: Действует как сильный дипольный растворитель, взаимодействуя преимущественно с аналитами, обладающими постоянными диполями.
Рассмотрим смесь, содержащую полигидроксисоединение и простой ароматический углеводород:
- В подвижной фазе метанол/вода полигидроксисоединение образует сильные водородные связи с подвижной фазой, что может ускорить его элюирование относительно углеводорода.
- В подвижной фазе ацетонитрил/вода способность к образованию водородных связей уменьшается. Полигидроксисоединение должно полагаться в основном на свою присущую гидрофобность для удерживания, что может значительно замедлить его элюирование.
Следовательно, изменение органического модификатора может инвертировать относительный порядок элюирования этих двух классов соединений.
Буферная соль
Выбор буферной соли может вызвать значительные сдвиги в порядке элюирования, особенно при переходе между фосфатной и ацетатной аммонийной системами, даже если обе поддерживаются при одинаковом номинальном pH. Это изменение в основном обусловлено ионной силой и эффективностью экранирования силанолов.
Фосфатные буферные системы (например, KH2PO4)
- Поддерживают высокую ионную силу и подвергаются многостадийной диссоциации.
- Обеспечивают надежный экранирующий эффект, который маскирует вторичные электростатические взаимодействия между основными аналитами и остаточными, непрореагировавшими силанольными группами (Si-OH) на поверхности кремнезема.
- Подавляют как электростатическое удерживание, так и вторичные водородные связи.
Системы ацетата аммония
- Обладают более низкой ионной силой и другой динамикой сольватации по сравнению с фосфатными буферами.
- Обеспечивают менее эффективное экранирование поверхностных силанолов.
Если образец содержит сильноосновной аналит и нейтральный аналит, их поведение будет различаться в зависимости от химии буфера.
- В фосфатной системе взаимодействие основного соединения с остаточными силанолами эффективно маскируется, что приводит к его поведению как чисто нейтральной молекулы с умеренным удерживанием.
- При переходе на систему ацетата аммония уменьшенное экранирование позволяет основному аналиту сильно взаимодействовать с ионизированными силанолами, что вызывает хвост пика и значительное увеличение удерживания.
Этот локальный сдвиг может привести к тому, что основной аналит будет элюироваться значительно позже нейтрального аналита, что приведет к инверсии исходного профиля элюирования.
Заключение
Будь то изменения, вызванные pH, изменения в динамике водородных связей из-за органических модификаторов или маскировка силанолов буферными солями, изменения подвижной фазы смещают лежащие в основе коэффициенты распределения (KD) аналитов между стационарной и подвижной фазами.
При установлении альтернативных условий подвижной фазы или замене реагентов в процессе разработки метода крайне важен эмпирический структурный анализ аналитов. В случаях инверсии порядка элюирования изучите химические структуры аналитов, а также свойства, которые могут влиять на удерживание. В большинстве случаев основная причина может быть выявлена благодаря систематическому пониманию хроматографических принципов.