![[Readers Insight] What Happens If Formic Acid Was Replaced by Acetic Acid in HPLC Analysis?](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/acetic-acid-1080_750x.jpg?v=1781761748)
[Readers Insight] Что произойдет, если муравьиную кислоту заменить уксусной в ВЭЖХ-анализе?
Эта статья написана штатным автором Welch's Chromatography Mound. Содержание статьи представляет исключительно точку зрения автора.
Введение
Асахи — новичок в хроматографической лаборатории. Однажды, готовя подвижную фазу для своего эксперимента, он обнаружил, что муравьиная кислота закончилась. Подумав, что поскольку муравьиная кислота и уксусная кислота являются слабыми органическими кислотами со схожей структурой, он просто взял стоящую рядом ледяную уксусную кислоту и добавил ее в водную фазу, полагая, что это не сильно повлияет и должно сработать.
Разумеется, его эксперимент обернулся катастрофой. В мире хроматографии такого рода «предполагаемая замена» часто приводит хроматограммы в полный беспорядок. В этой статье мы обсудим, что может произойти с хроматограммой, если мы действительно заменим муравьиную кислоту в подвижной фазе эквимолярной концентрацией уксусной кислоты.
Сценарий 1: Полное смещение времен удерживания, порядка элюирования и формы пиков
Цель добавления кислоты — обеспечить стабильное поступление ионов водорода. pKa муравьиной кислоты составляет 3,75, тогда как pKa уксусной кислоты — 4,76. Поскольку формула для расчета pKa является логарифмической, разница в одну единицу означает, что константа диссоциации кислоты (Ka) муравьиной кислоты примерно в 10 раз сильнее, чем у уксусной кислоты.
Для слабокислых целевых аналитов нам требуется достаточная кислотность, чтобы надежно подавить их до нейтрального молекулярного состояния, позволяя им правильно удерживаться на колонке C18. Если муравьиная кислота заменена уксусной кислотой, pH подвижной фазы увеличится. Видя такую мягкую окружающую среду, целевые аналиты немедленно депротонируются и ионизируются, беспорядочно перемещаясь внутри колонки, как сбежавшая лошадь. Результатом может быть резкое смещение времен удерживания и, в некоторой степени, ухудшение формы пиков.
Сценарий 2: Сильный подъем или дрейф базовой линии
Предположим, мы используем фотодиодный детектор (PDA), особенно для обнаружения соединений, чьи максимальные длины волн поглощения находятся в низкочастотном диапазоне (например, около 210 нм). Замена кислоты в этот момент эквивалентна надеванию солнцезащитных очков на детектор. Длина волны отсечки УФ-излучения муравьиной кислоты очень низка (около 210 нм), тогда как для уксусной кислоты она достигает примерно 230 нм, что выше, чем у муравьиной кислоты.
В результате, при переходе от муравьиной кислоты к уксусной, детектор ведет себя так, как будто на нем очки для астигматизма — он не полностью слеп, но видит не так ясно, как раньше. Кроме того, базовая линия может дрейфовать, как воздушный змей с оборванной нитью, шум может стать плотным и зубчатым, а равновесие системы становится трудно стабилизировать. Наконец, следовые пики примесей, которые изначально были слабо видны, могут быть полностью скрыты высоким фоновым поглощением уксусной кислоты.
Чтобы компенсировать потерю «видимости», целевой аналит должен быть «чище» — это означает, что ему требуется более высокий отклик; однако это не только снижает чувствительность, но и компрометирует количественную точность.
Сценарий 3: Сильное влияние на отклик масс-спектрометрии
В источнике ионизации электрораспылением (ESI) режим положительных ионов обычно сильно зависит от непрерывного потока протонов водорода, выделяемых муравьиной кислотой, чтобы помочь целевым аналитам образовывать ионы [M+H]+. Если заменить ее уксусной кислотой, которая обладает относительно более слабой ионизирующей способностью, эффективность образования ионов водорода будет значительно снижена.
Хотя влияние на отклик кислых соединений может быть незначительным, значения отклика для слабоосновных соединений могут катастрофически снизиться.
С другой стороны, уксусная кислота не совсем бесполезна для соединений, анализируемых в режиме отрицательных ионов. При анализе специфических высокополярных веществ (например, некоторых гликозидов) ацетат-ион может связываться с целевым аналитом, образуя стабильный аддукт [M+CH3COO]-. В этих случаях значение отклика иногда может значительно превосходить таковое для муравьиной кислоты.
Заключение
В мире хроматографии небольшое отклонение в начале может привести к огромной ошибке в конце. Муравьиная кислота является частым гостем в хроматографии и масс-спектрометрии, потому что она снижает pH, улучшает форму пиков и удобна для МС. Уксусная кислота также имеет свое назначение, но в большинстве случаев она не может легко заменить муравьиную кислоту.
При разработке метода каждый реагент и расходный материал выбирается для определенной цели. Мы не можем просто заменять один реагент или расходный материал другим на полпути и ожидать, что они обеспечат бесшовную замену.