[Взгляд читателей] Отправная точка в разработке метода

Выбор отправной точки для разработки метода давно беспокоит многих аналитиков, работающих в области фармацевтических испытаний, особенно сейчас, в связи с растущим количеством новых препаратов. Как выбрать систему подвижной фазы, колонку, разбавитель и другие хроматографические условия при наличии неизвестного соединения и отсутствии справочной литературы? Какая логика лежит в основе этого выбора?

В этой статье мы изучаем и анализируем метод, описанный в фармакопее, в качестве примера для иллюстрации данного подхода. В качестве примера мы используем раздел «Определение сопутствующих веществ аспирина» из Китайской фармакопеи. Мы изучаем параметры метода, выявляем потенциальные возможности его оптимизации и предлагаем улучшения.

Растворитель: метанол, содержащий 1% ледяной уксусной кислоты.

Раствор образца: аккуратно взвесьте около 0,1 г образца и поместите его в мерную колбу объемом 10 мл, добавьте соответствующее количество растворителя, встряхните для растворения и разбавления до отметки, затем тщательно перемешайте.

Эталонный раствор: аккуратно отмерьте пипеткой 1,0 мл раствора образца в мерную колбу объемом 200 мл и разбавьте до отметки растворителем; тщательно перемешайте.

Хроматографические условия:

• Упаковочный материал: связанный диоксид кремния C18.
• Подвижная фаза:
  А) Ацетонитрил–тетрагидрофуран–ледяная уксусная кислота–вода (20:5:5:70)
  Б) Ацетонитрил
• Длина волны обнаружения: 276 нм
• Объем инъекции: 10 мкл
• Градиентное элюирование:

Требования к пригодности системы: время удерживания пика аспирина составляет приблизительно 8 минут; разрешение между пиком аспирина и пиком салициловой кислоты должно соответствовать указанным требованиям.

В качестве разбавителя используется метанол, содержащий 1% ледяной уксусной кислоты, тогда как исходный состав подвижной фазы (А) не содержит метанола и содержит 70% водной фазы. Такое сочетание может привести к эффекту растворителя, ухудшающему форму пика.

Поскольку объем вводимой пробы в данном случае относительно невелик (10 мкл), влияние растворителя может быть не очевидным; однако при выборе разбавителя следует по возможности использовать систему, близкую по составу к исходной подвижной фазе, чтобы минимизировать риск влияния растворителя.

Подвижная фаза A содержит 5% тетрагидрофурана (ТГФ), назначение которого неясно. В хроматографии ТГФ обычно используется в концентрациях <20% и, как правило, применяется для улучшения разделения сложных профилей примесей. Исходя из требований к пригодности системы, единственной примесью, вызывающей беспокойство, является салициловая кислота, которая существенно отличается по гидрофобности от основного компонента; разделение не должно быть сложным, и, теоретически, ТГФ не должен быть необходимым .

С точки зрения реагента, ТГФ имеет характерный запах, и большинство коммерческих ТГФ содержат антиоксидант BHT для предотвращения окисления; BHT обладает сильным поглощением УФ-излучения и поэтому неблагоприятен при низких длинах волн детектирования (в этом методе длина волны составляет 276 нм, поэтому проблемы базовой линии могут быть незначительными).

Кроме того, ТГФ может вызывать разбухание материалов ПЭЭК, а длительное использование может сделать ПЭЭК хрупким и склонным к растрескиванию; могут образовываться частицы, которые могут даже засорить трубки. Поэтому следует избегать использования ТГФ с приборами, содержащими компоненты из ПЭЭК .

Содержание уксусной кислоты в подвижной фазе А составляет 5%, что относительно много. Диапазон буферных значений уксусной кислоты обычно составляет 4–6; 5%-ный раствор уксусной кислоты имеет pH около 2,4, что выходит за пределы буферного диапазона.

Структурный анализ показывает, что как основное соединение, так и примесь содержат фрагмент бензойной кислоты: поскольку карбоксильная группа сопряжена с ароматическим кольцом, производное бензойной кислоты обладает более сильной кислотностью, чем уксусная кислота (т.е. имеет более низкое значение pKa). Для обеспечения адекватного удерживания желательно сохранять эти соединения в молекулярной (неионизированной) форме ; для этого и служит добавленная уксусная кислота.

Однако, поскольку уксусная кислота слабее производного бензойной кислоты, это может объяснить, почему было использовано такое относительно большое ее количество (5%).

Время градиентного анализа составляет 60 минут, тогда как основной пик элюируется примерно через 8 минут; таким образом, время анализа чрезмерно велико.

Основное соединение содержит дополнительную ацетильную группу по сравнению с примесью и, следовательно, должно быть более гидрофобным; для разделения должно быть достаточно обычной колонки C18 . Учитывая профиль примесей (если салициловая кислота является единственной значимой примесью), можно выбрать более короткую колонку — 50 мм или даже 30 мм — для значительного сокращения времени анализа на один ввод.

В качестве подвижной фазы А используйте 0,1% водный раствор фосфорной кислоты.

Фосфорная кислота — умеренно сильная кислота, диссоциирующая в три стадии; первая стадия диссоциации имеет эффективный буферный диапазон pH приблизительно от 1,12 до 3,12. 0,1%-ный водный раствор фосфорной кислоты имеет pH, близкий к 2 , и его вполне достаточно для подавления ионизации карбоксильной группы бензойной кислоты.

Эта подвижная фаза дополнительно помогает снизить длину волны детектора, см. ниже.

В представленном методе концентрация образца составляет 10 мг/мл, что относительно много, а выбранная длина волны детектирования — 276 нм. Эта длина волны может соответствовать локальному минимуму в спектре поглощения, а абсолютная величина поглощения может быть невысокой, что приводит к низкой чувствительности; отсюда и необходимость в повышенной концентрации образца для компенсации.

Поэтому рекомендуется использовать подвижную фазу на основе водной фосфорной кислоты и ацетонитрила, УФ-отсечка подвижной фазы которой составляет <210 нм (для сравнения, система ТГФ, содержащая BHT, обычно требует длины волны детектирования выше ~260 нм), что позволяет повысить чувствительность, а также снизить длину волны детектирования и концентрацию образца.