[Взгляд читателей] Отправная точка в разработке метода

Выбор отправной точки для разработки метода давно беспокоит многих аналитиков, занимающихся фармацевтическими испытаниями, особенно сейчас, когда количество новых лекарств постоянно растет. При наличии неизвестного соединения и отсутствии справочной литературы, как следует выбирать систему подвижной фазы, колонку, растворитель и другие хроматографические условия? Какова логика этих выборов?

В этой статье мы изучаем и анализируем метод, описанный в фармакопее, в качестве примера, чтобы проиллюстрировать подход. В качестве примера мы используем запись «Определение родственных веществ аспирина» в Китайской фармакопее, где мы исследуем настройки метода, выявляем потенциальные оптимизации и предлагаем улучшения.

Растворитель: Метанол, содержащий 1% ледяной уксусной кислоты.

Раствор образца: Точно взвесьте около 0,1 г образца в мерную колбу объемом 10 мл, добавьте соответствующее количество растворителя, встряхните для растворения и доведите до метки, затем тщательно перемешайте.

Эталонный раствор: Точно отберите пипеткой 1,0 мл раствора образца в мерную колбу объемом 200 мл и доведите до метки растворителем; тщательно перемешайте.

Хроматографические условия:

• Наполнитель: Силикагель, связанный с C18.
• Подвижная фаза:
  A) Ацетонитрил–тетрагидрофуран–ледяная уксусная кислота–вода (20:5:5:70)
  B) Ацетонитрил
• Длина волны детектирования: 276 нм
• Объем инжекции: 10 мкл
• Градиентное элюирование:

Требования к пригодности системы: Время удерживания пика аспирина составляет приблизительно 8 минут; разрешение между пиком аспирина и пиком салициловой кислоты должно соответствовать указанным требованиям.

Разбавитель представляет собой метанол, содержащий 1% ледяной уксусной кислоты, тогда как начальный состав подвижной фазы (A) не содержит метанола и состоит из 70% водной фазы. Такое несоответствие может вызвать сольвентные эффекты, ухудшающие форму пика. 

Поскольку объем инжекции здесь относительно невелик (10 мкл), сольвентные эффекты могут быть неочевидны; однако при выборе разбавителя следует по возможности использовать систему, аналогичную по составу исходной подвижной фазе, чтобы минимизировать риск сольвентных эффектов.

Подвижная фаза А содержит 5% тетрагидрофурана (ТГФ), цель которого неясна. В хроматографии ТГФ обычно используется в концентрациях <20% и, как правило, применяется для улучшения разделения сложных профилей примесей. Из требований к пригодности системы видно, что единственной интересующей примесью является салициловая кислота, которая существенно отличается по гидрофобности от основного компонента; разделение не должно быть сложным, и, теоретически, ТГФ не должен быть необходим.

С реагентной точки зрения, ТГФ имеет характерный запах, и большинство коммерческих ТГФ содержат антиоксидант БГТ для предотвращения окисления; БГТ имеет сильное УФ-поглощение и поэтому неблагоприятен при низких длинах волн детектирования (в этом методе длина волны составляет 276 нм, поэтому проблемы с базовой линией могут быть незначительными). \ 

Кроме того, ТГФ может вызывать набухание материалов PEEK, и длительное использование может сделать PEEK хрупким и склонным к растрескиванию; могут образовываться частицы, которые даже могут блокировать трубки. Поэтому ТГФ следует избегать на приборах, содержащих компоненты PEEK.

Содержание уксусной кислоты в подвижной фазе А составляет 5%, что относительно много. Полезный буферный диапазон уксусной кислоты обычно составляет pH 4–6; 5% раствор уксусной кислоты имеет pH около 2,4, что находится за пределами буферного диапазона. 

Из структурного анализа следует, что как основное соединение, так и примесь содержат бензойную кислоту: поскольку карбоксильная группа сопряжена с ароматическим кольцом, производное бензойной кислоты проявляет более сильную кислотность, чем уксусная кислота (т.е. имеет более низкую pKa). Для обеспечения адекватного удерживания желательно сохранять эти соединения в их молекулярной (неионизированной) форме; добавленная уксусная кислота служит этой цели. 

Однако, поскольку уксусная кислота слабее производного бензойной кислоты, это может объяснить, почему использовалось такое относительно большое количество (5%).

Время градиентного элюирования составляет 60 минут, при этом основной пик элюируется примерно через 8 минут; таким образом, время выполнения чрезмерно велико.

Основное соединение содержит дополнительную ацетильную группу по сравнению с примесью и, следовательно, ожидается, что оно будет более гидрофобным; для разделения должна быть достаточна обычная колонка C18. Учитывая профиль примесей (если салициловая кислота является единственной значимой примесью), можно выбрать более короткую колонку — 50 мм или даже 30 мм в длину — чтобы значительно сократить время выполнения одной инжекции.

Используйте 0,1% водный раствор фосфорной кислоты в качестве подвижной фазы А. 

Фосфорная кислота — умеренно сильная кислота, диссоциирующая в три этапа; первая диссоциация имеет эффективный буферный диапазон приблизительно от pH 1,12 до 3,12. 0,1% водный раствор фосфорной кислоты имеет pH около 2 и вполне достаточен для подавления ионизации карбоксильной группы бензойной кислоты.

Эта подвижная фаза дополнительно помогает снизить длину волны детектора, см. ниже.

В представленном методе концентрация образца составляет 10 мг/мл, что является относительно высоким показателем, а выбранная длина волны детектирования — 276 нм. Эта длина волны может соответствовать локальному минимуму в спектре поглощения, и абсолютное поглощение может быть невысоким, что приводит к низкой чувствительности; отсюда и повышенная концентрация образца для компенсации. 

Поэтому рекомендуется использовать подвижную фазу, состоящую из водной фосфорной кислоты и ацетонитрила, чья УФ-отсечка подвижной фазы составляет <210 нм (напротив, система с ТГФ, содержащая БГТ, обычно требует длины волны детектирования выше ~260 нм), что позволяет улучшить чувствительность при одновременном снижении длины волны детектирования и концентрации образца.