![[Readers Insight] How to Quickly Establish Robust HPLC Analytical Methods: A 5-Step Expert Guide](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/webp_03042904-1b2e-4fcd-8803-6dc1c58818a8_750x.webp?v=1765523545)
Как быстро создать надежные аналитические методы ВЭЖХ: 5-шаговое руководство эксперта
Автор: Chromatography Mound
Оглавление
Введение
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — широко используемый аналитический метод в лабораториях. По сравнению со спектрофотометрией, ВЭЖХ позволяет проводить одновременный анализ нескольких соединений. Масс-спектрометрия может обеспечивать более высокую чувствительность, в то время как ВЭЖХ обеспечивает более широкую область применения и более низкие эксплуатационные расходы.
Однако определение того, когда следует использовать ВЭЖХ и как эффективно разработать надёжный аналитический метод, требует накопления опыта. В большинстве обычных лабораторий исследователи редко разрабатывают метод ВЭЖХ с нуля. Вместо этого они часто полагаются на национальные стандартные методы или переносят установленные параметры со старых приборов на новые.
В данной статье описывается пошаговый подход к разработке методов ВЭЖХ, основанный на практическом опыте, призванный помочь начинающим хроматографистам создавать надежные методы более эффективно.
1. Проанализируйте химическую структуру целевого соединения.
Четкое понимание химической структуры аналита необходимо по двум основным причинам:
1.1 Выбор подходящего детектора
- Если соединение имеет сопряженную систему (например, ароматические кольца или протяженные π-связи), можно использовать УФ-детекторы, фотодиодные матричные детекторы (PDA/DAD) или флуоресцентные детекторы (FLD).
- Если ароматические кольца или протяженные π-связи отсутствуют, особенно если в соединении отсутствуют сильные хромофоры, детектирование флуоресценции может давать низкую чувствительность.
- Для неконъюгированных соединений следует рассмотреть возможность использования испарительных детекторов рассеяния света (ELSD) или детекторов показателя преломления (RID).
Чувствительность детектора также зависит от концентрации аналита и коэффициента разбавления при подготовке образца:
- Детекторы PDA обычно достигают предела обнаружения около 0,1 ppm.
- Детекторы FLD могут достигать чувствительности на уровне ppb.
- Детекторы ELSD и RID обычно обнаруживают в диапазоне 10–50 ppm (зависит от прибора).
1.2 Руководство по подготовке образцов и выбору подвижной фазы
Структурный анализ помогает определить:
- Полярность экстракционных растворителей,
- Тип необходимых сорбентов для очистки,
- Подходящий состав подвижной фазы и градиентные условия.
2. Выберите подходящий растворитель для экстракции.
Полярность матрицы образца и аналита определяет выбор растворителя для экстракции:
- Если разница полярностей между ними велика, то обычно эффективен растворитель с полярностью, более близкой к целевому соединению.
- Если разница полярностей невелика, может потребоваться растворитель с полярностью, далекой от матрицы, возможно, в сочетании с несколькими этапами экстракции и процедурами очистки для минимизации помех со стороны матрицы.
3. Оцените реакцию детектора и при необходимости примените усиление сигнала.
Оцените, является ли ответ сигнала аналита адекватным на основе чувствительности детектора (т. е. предела обнаружения):
- Если низкая реакция обусловлена молекулярной структурой , можно использовать дериватизацию для введения сильно реагирующих функциональных групп.
-
Если низкий ответ обусловлен низкой концентрацией аналита , рассмотрите методы предварительной концентрации, такие как:
- Твердофазная экстракция (ТФЭ),
- Испарение азота,
- Жидкостно-жидкостная микроэкстракция.
Эти подходы уменьшают разбавление и увеличивают концентрацию аналита в инъекционном растворе.
4. Подготовьте подвижную фазу и оптимизируйте условия элюирования.
Правильный выбор подвижной фазы и программирование элюирования имеют решающее значение для достижения эффективного разделения:
- Выбор колонки : большинство соединений хорошо удерживаются колонками C18 или C8. По сравнению с колонками C18, колонки C8 обеспечивают лучшее удерживание умеренно полярных соединений.
- Для ионизируемых соединений (например, аминов, карбоновых кислот, солей) добавление буферных солей увеличивает ионную силу, подавляет уширение пиков и улучшает постоянство удерживания.
Стратегии элюирования :
-
Градиентное элюирование подходит для сложных смесей (например, для разделения многокомпонентных аналитов). Типичный протокол градиентного элюирования:
- Начните с 5–10% органической фазы,
- Удерживайте в течение 2–5 минут,
- Постепенно увеличивайте концентрацию органической фазы,
- После элюирования последнего аналита вернитесь в исходное состояние в течение 0,5 минут.
- Подождите 5 минут, чтобы снова уравновесить колонку.
- Изократическое элюирование эффективно для более простых образцов. Благодаря точной настройке соотношения органических компонентов таким образом, чтобы первый аналит элюировался в течение 5–10 минут, достигается оптимальное разделение целевых аналитов и примесей.
5. Проверка восстановления и стабильности метода
Провести валидацию метода, уделив особое внимание скорости восстановления и относительному стандартному отклонению (RSD):
- Выполните шесть повторений для трех уровней концентрации (1×, 2× и 5× LOD).
- Проанализируйте результаты и рассчитайте степень восстановления и относительное стандартное отклонение.
Приемлемые критерии эффективности метода обычно включают:
- Восстановление от 80% до 120% ,
- RSD ниже 10% .
Заключение
Следуя этой пятиэтапной стратегии — структурный анализ, выбор растворителя, оценка отклика, оптимизация метода и валидация — можно эффективно решить большинство задач, связанных с разработкой методов ВЭЖХ. Чёткое понимание основополагающих принципов позволяет хроматографистам выявлять и адаптировать методы даже в сложных условиях, обеспечивая надёжную и стабильную аналитическую эффективность.