![[Readers Insight] Is Elution Order Determined Solely by the Polarity of a Compound?](http://www.welch-us.com/cdn/shop/articles/elution-order-vs-polarity-1080-731_750x.jpg?v=1785721048)
[Взгляд читателя] Определяется ли порядок элюции исключительно полярностью соединения?
Эта статья написана штатным автором Welch's Хроматографи Маунд. Содержание статьи представляет исключительно точку зрения автора.
Предыдущая статья:
Определяется ли время удерживания исключительно полярностью соединения?
Введение
На вводных курсах по жидкостной хроматографии почти каждый новичок слышал следующее утверждение: «В обращенно-фазовой хроматографии более полярные соединения элюируются первыми, а менее полярные — позже.»
Это утверждение дает полезное общее руководство, которое новички часто воспринимают как почти абсолютное правило. Столкнувшись с двумя структурно схожими соединениями, они изучают их молекулярные структуры, иногда рассчитывают значения LogP и приходят к выводу: «Аналит А более полярен, чем Аналит B, поэтому А элюируется раньше B».
Однако если бы хроматография была так проста, химики, занимающиеся разработкой методов, давно остались бы без работы. В этой статье мы более подробно рассмотрим, почему порядок элюирования в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии никогда не может быть сведен только к полярности соединения, используя в качестве примера неподвижные фазы C18.
Более полярные соединения элюируются раньше?
Утверждение, что «более полярные соединения элюируются первыми», по сути, является упрощенным обобщением поведения удерживания, наблюдаемого в обращенно-фазовой хроматографии.
Неподвижная фаза колонок C18 состоит из длинных гидрофобных алкильных цепей, тогда как подвижная фаза обычно состоит из сильнополярной воды, смешанной с органическим растворителем. Аналит удерживается на колонке не просто потому, что он не обладает полярностью, а потому, что он проявляет гидрофобность, обеспечивая гидрофобные взаимодействия с цепями C18.
В большинстве случаев полярность и гидрофобность обратно коррелируют. Однако часто возникают расхождения из-за таких факторов, как размер молекулы и площадь поверхности контакта.
Рассмотрим два соединения с почти идентичной полярностью: соединение А имеет громоздкое алициклическое кольцо, тогда как соединение B содержит только метильную группу (см. ниже). С точки зрения чистой полярности они практически неразличимы. Однако, поскольку соединение А имеет больший молекулярный объем, оно подвергается большей степени гидрофобного поверхностного контакта — и, следовательно, более сильным силам Ван-дер-Ваальса — с неподвижной фазой C18. В результате время удерживания соединения А может быть значительно больше, чем у соединения B.
Факторы, помимо полярности, определяющие порядок элюирования
В термодинамическом равновесии, управляющем удерживанием на колонке, порядок элюирования определяется тем, какой аналит проявляет более сильное общее сродство к неподвижной фазе относительно подвижной фазы. Полярность является лишь одним из многих факторов, а не единственным определяющим фактором.
Помимо гидрофобных взаимодействий, в хроматографической системе могут также возникать различные вторичные взаимодействия. Эти взаимодействия могут значительно изменить ожидаемый порядок элюирования.
Вторичные взаимодействия с остаточными силанольными группами
Взаимодействия с остаточными силанольными группами представляют собой один из наиболее проблемных вторичных механизмов удерживания, особенно для основных соединений. Хотя большинство современных колонок C18 подвергаются обработке по блокированию концевых групп, небольшое количество непрореагировавших силанольных групп (−Si−OH) может все еще оставаться на поверхности силикагеля.
Когда соединение содержит слабоосновные вторичные или третичные аминогруппы, эти группы могут протонироваться, если pH подвижной фазы ниже pKa соединения. Аналит тогда несет положительный заряд и может сильно взаимодействовать с отрицательно заряженными силанольными участками посредством электростатических взаимодействий. В этих условиях даже сильнополярное соединение может испытывать сильное удерживание и сильное расслаивание пика из-за этих ионных взаимодействий.
Кроме того, водородные связи являются еще одним важным вторичным взаимодействием. Соединения, содержащие функциональные группы, такие как амины, гидроксильные группы или карбоновые кислоты, могут образовывать водородные связи с остаточными силанольными группами, что еще больше увеличивает удерживание.
π–π взаимодействия
При использовании фенильных колонок, пентафторфенильных (PFP) колонок или некоторых сопряженных гиперсшитых ароматических неподвижных фаз на аналитах, содержащих ароматические кольца или сопряженные двойные связи, могут возникать дополнительные взаимодействия. Неподвижная фаза может взаимодействовать с ароматическим ядром аналита посредством перекрытия π–π электронных облаков. Даже если молекула аналита обладает относительно высокой полярностью, ее удерживание все равно может увеличиться, если ее ароматическая электронная система сильно взаимодействует с неподвижной фазой.
Изменение pH подвижной фазы
pH подвижной фазы — это единственный параметр, наиболее способный изменить предсказанный порядок элюирования. Полярность не является неизменной физической константой; в водных системах это динамический параметр, зависящий от состояния ионизации.
Например, аспирин (ацетилсалициловая кислота) является слабой кислотой. При pH подвижной фазы 3,0 он остается преимущественно неионизированным (нейтральным), проявляя более низкую кажущуюся полярность и сильное удерживание на колонке C18. Однако, когда pH подвижной фазы повышается до 6,0, он ионизируется в карбоксилатный анион, что резко увеличивает его полярность и уменьшает удерживание. Если анализировать его наряду с нейтральным соединением, не подверженным влиянию pH (например, толуолом), регулирование pH может полностью изменить последовательность их элюирования.
Следовательно, значения полярности, рассчитанные из статической молекулярной структуры, могут легко стать неточными предсказаниями при применении к динамической хроматографической среде.
Стерические препятствия
Стерические эффекты играют важную роль в определении того, может ли молекула эффективно получить доступ к неподвижной фазе и взаимодействовать с ней.
Поверхность неподвижной фазы C18 не является совершенно гладкой. Вместо этого она напоминает плотную «щетку», образованную слоями октадецильных цепей. Для эффективного взаимодействия аналита с неподвижной фазой он должен проникнуть в эту гидрофобную область. Следовательно, трехмерная структура молекулы может значительно влиять на удерживание.
Рассмотрим н-бутанол (линейный) по сравнению с трет-бутанолом (разветвленный). Оба имеют одну и ту же молекулярную формулу (C4H10O) и очень схожую полярность. Однако на колонке с обращенной фазой объемная, зонтикообразная трет-бутильная группа вызывает существенное стерическое препятствие, не позволяя молекуле проникать в алкильные цепи C18 и приводя к более слабому общему удерживанию, поэтому она элюируется значительно раньше, чем н-бутанол.
Заключение
По своей сути порядок элюирования определяется коэффициентом распределения аналита между неподвижной и подвижной фазами. Полярность — это лишь одна из многих переменных, влияющих на это равновесие.
При разработке методов ВЭЖХ или идентификации пиков не следует рассматривать правило «более полярные соединения элюируются первыми» как абсолютное. Строгая оценка должна учитывать:
- Насколько велика площадь молекулярного контакта с неподвижной фазой?
- Могут ли функциональные группы взаимодействовать с остаточными силанольными центрами?
- Изменяет ли pH подвижной фазы состояние ионизации соединения?
- Могут ли ароматические структуры участвовать в π–π взаимодействиях с неподвижной фазой?
- Препятствуют ли стерические эффекты доступу молекулы к неподвижной фазе?
Истинная сила жидкостной хроматографии заключается в том, что поведение удерживания никогда не определяется одним правилом, а является результатом множества конкурирующих межмолекулярных сил, действующих параллельно.