Валидация метода определения содержания ВЭЖХ: подробное руководство

При валидации метода ВЭЖХ аналитики всегда должны обращать внимание на повторные исследования фармакопеи и опубликованные вместе с ней стандартные операционные процедуры (СОП). Важность первой очевидна, но вторая часто игнорируется подавляющим большинством аналитиков.

Многие аналитики допускают фундаментальные ошибки в экспериментах или теряются при возникновении проблем, хотя эти операционные ошибки часто описываются в СОП фармакопеи. Поэтому, чтобы освоить разработку методов, необходимо многократно изучать фармакопею и ее СОП, пока они не станут второй натурой.

Эта статья посвящена ключевым моментам в процессе валидации метода ВЭЖХ для определения содержания, служа в качестве справочника для читателей. Любые упущения или недостатки будут любезно учтены. Обратите внимание, что процедуры могут незначительно отличаться в разных фармакопеях.

Порядок выполнения работ: Оптимизировать условия градиента и определить аналитическую длину волны:

1. Выбрать растворитель для образца;
2. Протестировать адсорбцию на мембранном фильтре;
3. При использовании детектора DAD выбрать длину волны при максимальном поглощении основных компонентов или на плато;
4. Выбрать условия разделения;
5. Сравнить колонки ВЭЖХ (в соответствии с требованиями);
6. При использовании детектора DAD протестировать воду, 1 моль/л кислоту, основание, кислород (10% перекись водорода), воздействие света и высокотемпературное разложение, а также разделение исходных материалов, промежуточных продуктов и вспомогательных веществ (для исследований составов должно одновременно проводиться разложение вспомогательных веществ-плацебо).

Технические моменты:

1. Это исследование необходимо, если нет эталонного стандарта или стандартный метод не может быть применен напрямую.
2. Растворитель для образцов: Должен хорошо растворять образец, оставаться стабильным при комнатной температуре более 12 часов и быть смешиваемым с подвижной фазой.
3. Площадь пика фильтрата должна достигать стабильного максимального значения. Предпочтителен объем фильтрата менее 5 мл; в противном случае необходимо пересмотреть выбор растворителя.
4. Рекомендуется разложение примерно на 10% (5–15%). Если образец не разлагается после погружения в 2 моль/л кислоту или основание при 90°C в течение 12 часов, он считается стабильным, и дальнейшее разложение не требуется. Воздействие света 4500 лк в течение 48 часов необходимо как для порошка образца, так и для раствора. После разложения как раствор образца, так и растворитель-плацебо должны быть отрегулированы до рН подвижной фазы перед инжекцией, чтобы предотвратить неблагоприятное воздействие на колонку. Если разложение превышает 20%, условия разложения следует уменьшить.
5. Разрешение должно быть адекватным, без помех при количественном определении, и каждый пик должен соответствовать требованиям к чистоте единичного пика.
6. Градиентный метод должен включать этап с максимальной элюирующей способностью, чтобы обеспечить элюирование и обнаружение всех примесей.
7. Процесс исследования и оптимизации метода обычно не документируется, но отражается в лабораторном журнале. Если нет установленной методической основы, выбор градиента и длины волны необходимо документировать.
8. Оптимизированный метод следует использовать для анализа всех образцов в один и тот же день, одним и тем же лицом, с использованием одного и того же прибора для окончательной проверки, чтобы обеспечить сопоставимость.
9. Эксперименты по оптимизации метода следует проводить с использованием лабораторных образцов небольшого масштаба, когда производственный процесс фиксирован. На ранних этапах синтеза сырья для предварительного анализа примесей может использоваться широкая градиентная элюция.

Порядок выполнения работ: Цель состоит в том, чтобы проверить способность метода дифференцировать целевые компоненты и всесторонне оценить анализ примесей.

При использовании детектора DAD или подходящего универсального детектора анализировать воду, 1 моль/л кислоту, основание, кислород (10% перекись водорода), воздействие света и высокотемпературное разложение на исходных материалах, промежуточных продуктах, вспомогательных веществах и эталонных стандартах примесей в один и тот же день. Их можно использовать для обоснования обсуждений профиля примесей в документации для подачи заявки.

Технические моменты:

1. Подготовить деградированные образцы в соответствии с вышеуказанной процедурой, включая плацебо и отрицательные образцы.
2. Обеспечить хорошее разделение, без количественных помех, и чтобы все пики соответствовали требованиям к чистоте единичного пика.
3. Градиентный метод должен включать этап с максимальной элюирующей способностью.
4. Все образцы должны быть проанализированы по заранее определенному методу в один и тот же день, одним и тем же лицом и с использованием одного и того же прибора для сопоставимости.
5. Для нормативной документации данные в идеале должны быть получены при валидации первой производственной партии.
6. Когда хроматографические условия соответствуют методам испытаний на примеси, данные о специфичности могут быть общими.
7. При подготовке хроматограмм необходимо включать УФ-спектр и графики чистоты пиков основного компонента.

Порядок выполнения работ: Применяется метод отношения сигнал/шум (S/N) — концентрация, при которой S/N ≥ 3, является ПО.

Технические моменты:

1. Сначала ввести холостой раствор, затем концентрированный эталонный раствор (1 мг/мл). Определить базовый шум в течение 1–2 мин при времени удерживания основного пика, измерить высоту пика и рассчитать ПО как утроенное значение этой высоты.
2. Развести исходный раствор до приблизительной расчетной концентрации.
3. Документация должна включать не менее трех хроматограмм (холостой раствор, концентрированный раствор и разбавленный раствор).

Порядок выполнения работ: Применяется метод отношения сигнал/шум (S/N) — концентрация, при которой S/N ≥ 10, является ПКО.

Технические моменты:

1. Рассчитать ПКО как десятикратную высоту пика базовой линии.
2. Развести раствор ПО до предполагаемой концентрации ПКО и ввести шесть раз, убедившись, что относительное стандартное отклонение (RSD) площади пика <2% (или до 5% при необходимости).
3. Документация должна включать шесть хроматограмм (разбавленные растворы из шести инжекций).
4. ПО и ПКО должны быть определены в один и тот же день, с использованием одинакового масштаба по вертикальной оси на хроматограммах для облегчения проверки регулирующими органами.

Порядок выполнения работ: Калибровочная кривая по 5 или 7 точкам, в зависимости от необходимости.

Технические моменты:

1. Первая точка должна быть при концентрации ПКО, средняя точка — при 100% концентрации, а последняя точка — при 200% концентрации (160% или 180% допустимо).
2. Корректировка концентрации должна производиться путем разбавления, а не изменения объема инжекции.
3. Требуется коэффициент корреляции r > 0.999.
4. Калибровка должна проводиться с использованием эталонных стандартов.
5. Наивысшая концентрация в тесте на восстановление должна находиться в пределах линейного диапазона; в противном случае количественное определение ненадежно. Это распространенная ошибка.

Порядок выполнения работ: Инжектировать один и тот же раствор образца шесть раз подряд.

Технические моменты:

1. Рассчитать RSD площади пика < 2%.
2. Документация должна включать семь хроматограмм (одна холостая, шесть инжекций образца).
3. Регуляторные данные должны быть получены при валидации первой производственной партии.

Порядок выполнения работ: Проводится параллельно с тестами на точность с хорошо спланированными временными интервалами. Хроматограммы для тестов на стабильность и точность в одни и те же моменты времени могут использоваться взаимозаменяемо для сокращения объема работ. Основные временные точки: 0, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24 часа (может быть сокращено только при наличии хорошо задокументированной стабильности).

Технические моменты:

1. Хроматограммы теста на точность могут быть использованы для оценки стабильности в течение 2, 4 или даже 6 часов.
2. Предоставить данные для шести выбранных временных точек из 7–8 измеренных.
3. Данные о стабильности должны подтверждать стабильность в течение не менее 16 часов; чем дольше, тем лучше. Автоматические инжекции в течение ночи могут продлиться более 12 часов без участия человека. Если период времени слишком короткий, данных может быть недостаточно для подтверждения стабильности.
4. В особых случаях могут применяться альтернативные операционные процедуры, такие как автосамплеры с низкой температурой, специальное хранение или свежеприготовленные растворы, но они должны быть валидированы с подтверждающими данными, чтобы быть внесенными в стандарты метода.
5. RSD площади пика за шесть временных точек должен быть <2%.

Порядок выполнения работ: Проанализировать два эталонных раствора и шесть тестовых растворов из одной и той же партии одним и тем же аналитиком и одним и тем же методом, каждый инжектируется один раз.

Технические моменты:

1. RSD содержания < 2%.
2. Документация должна включать девять хроматограмм (одна холостая, две эталонные, шесть тестовых образцов).
3. Регуляторные данные должны быть получены при валидации первой производственной партии.

Порядок выполнения работ: Проводится в другой день другим аналитиком с использованием другого прибора, согласно тому же методу. Снова анализировать два эталонных раствора и шесть тестовых растворов. Эталонные материалы должны быть повторно взвешены.

Технические моменты:

1. Чтобы избежать проблем с вариациями приборов, тест на промежуточную точность следует проводить на следующий день после других вышеуказанных процедур.
2. Все 12 результатов определения содержания (повторяемость + промежуточная прецизионность) должны быть включены в расчеты, с относительным стандартным отклонением (RSD) < 2%.
3. Документация должна включать 18 хроматограмм (9 из повторяемости, 9 из промежуточной прецизионности).
4. Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.

Порядок действий: Провести тест на извлечение. Для субстанций (АФИ) применяется прямое извлечение; для готовых лекарственных форм — извлечение с добавлением. Взвесить образцы в пропорциях 80%, 100% и 120%, по 3 образца для каждой пропорции. Каждый образец вводить один раз, используя тот же метод.

Технические моменты:

1. Использовать среднее содержание из тестов на промежуточную прецизионность в качестве теоретического значения.
2. Диапазон извлечения: 98%–102%, RSD < 2%.
3. Документация должна включать 12 хроматограмм (одна холостая проба, два референса, девять образцов). Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.
4. Для теста на извлечение с добавлением смешать и измельчить не менее 20 дозированных единиц, затем добавить образцы (взвешенные в пропорциях 80%, 100% и 120%) в соотношении 1:1.
5. Если вспомогательные вещества адсорбируют или мешают, что приводит к несоблюдению требований по извлечению с добавлением, вместо этого можно использовать прямое извлечение.

Смена колонки

Процедура:
Используйте ВЭЖХ-колонки трех разных производителей для сравнения эффективности разделения, времени удерживания и результатов анализа.

• Если недостаточно брендов, используйте несколько партий от одного или двух брендов.
• Не используйте испорченные или просроченные колонки для тестирования.

Технические моменты:

• В идеале, проводите тест в один день, используя два раствора образца и два раствора сравнения.
• Всего должно быть 15 хроматограмм с 3 колонок (одна холостая проба, два раствора сравнения и два раствора образца на каждую колонку).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа для шести повторностей (n=6) должно быть <2%.
• Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.

Соотношение подвижной фазы:

Процедура:
Изменяйте более низкий компонент подвижной фазы примерно на ±5%.

Технические моменты:

• В идеале, проводите тест в один день, используя два раствора образца и два раствора сравнения.
• Всего должно быть 15 хроматограмм для 3 соотношений (одна холостая проба, два раствора сравнения и два раствора образца на каждое соотношение).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа для шести повторностей (n=6) должно быть <2%.
• Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.
• Хроматограммы оптимального стандартного условия должны переделываться ежедневно для подтверждения эффективности колонки и предотвращения ошибочной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

Изменение скорости потока:

Процедура:
Изменяйте скорость потока на ±10%.

Технические моменты:

• В идеале, проводите тест в один день, используя два раствора образца и два раствора сравнения.
• Всего должно быть 15 хроматограмм для 3 скоростей потока (одна холостая проба, два раствора сравнения и два раствора образца на каждую скорость потока).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа для шести повторностей (n=6) должно быть <2%.
• Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.
• Хроматограммы оптимального стандартного условия должны переделываться ежедневно для подтверждения эффективности колонки и предотвращения ошибочной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

Различные условия pH:

Процедура:
Корректируйте значение pH на ±0,2.

Технические моменты:

• В идеале, проводите тест в один день, используя два раствора образца и два раствора сравнения.
• Всего должно быть 15 хроматограмм для 3 значений pH (одна холостая проба, два раствора сравнения и два раствора образца на каждое значение pH).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа для шести повторностей (n=6) должно быть <2%.
• Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.
• Хроматограммы оптимального стандартного условия должны переделываться ежедневно для подтверждения эффективности колонки и предотвращения ошибочной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

Температура колонки:

Процедура:
Изменяйте температуру колонки на ±5°C, проводя тестирование при 25°C, 30°C (или оптимальном параметре) и 35°C.

Технические моменты:

• В идеале, проводите тест в один день, используя два раствора образца и два раствора сравнения.
• Всего должно быть 15 хроматограмм для 3 температур (одна холостая проба, два раствора сравнения и два раствора образца на каждую температуру).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа для шести повторностей (n=6) должно быть <2%.
• Регуляторные данные должны поступать из валидации первой производственной партии.
• Хроматограммы оптимального стандартного условия должны переделываться ежедневно для подтверждения эффективности колонки и предотвращения ошибочной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

После завершения валидации метода и обеспечения соответствия всех оценочных параметров требуемым стандартам, проведите тестирование трех партий производственной верификации и референсного продукта в один и тот же день.

• Эти данные будут включены в отчет об инспекции продукта для предоставления в регулирующие органы.
• Они также служат данными стабильности для Дня 0.