Валидация метода определения содержания ВЭЖХ: подробное руководство

При валидации метода ВЭЖХ аналитикам следует всегда обращать внимание на повторные исследования фармакопеи и опубликованные вместе с ней стандартные операционные процедуры (СОП). Важность первой очевидна, но вторая часто игнорируется подавляющим большинством аналитиков.

Многие аналитики допускают фундаментальные ошибки в экспериментах или теряются при возникновении проблем, хотя эти операционные ошибки часто описаны в стандартных операционных процедурах (СОП) фармакопеи. Поэтому, чтобы освоить разработку методов, необходимо многократно изучать фармакопею и её СОП, пока они не станут для них привычными.

В данной статье рассматриваются ключевые моменты процесса валидации метода ВЭЖХ для определения содержания, и она может служить справочным материалом для читателей. Любые упущения или неточности принимаются к сведению. Также следует учитывать, что процедуры могут незначительно различаться в разных фармакопеях.

Рабочие процедуры: Оптимизация условий объективного градиента и определение аналитической длины волны:

1. Выбрать образец растворителя;
2. Испытание адсорбции на мембранном фильтре;
3. В разделе «ДД-детектор» выберите длину волны при максимальном поглощении основных компонентов или на плато;
4. Выберите условия разделения
5. Сравнение колонок ВЭЖХ (в соответствии с требованиями)
6. С помощью детектора DAD проверьте воду, кислоту 1 моль/л, основание, кислород (10% перекись водорода), воздействие света и высокотемпературную деградацию, а также разделение исходных материалов, промежуточных продуктов и вспомогательных веществ (для исследования рецептур одновременно следует проводить деградацию холостого вспомогательного вещества).

Технические моменты:

1. Данное исследование необходимо в случае, когда отсутствует эталонный стандарт или стандартный метод не может быть применен напрямую.
2. Растворитель для образцов: должен хорошо растворять образец, оставаться стабильным при комнатной температуре более 12 часов и смешиваться с подвижной фазой.
3. Площадь пика фильтрата должна достигать стабильного максимального значения. Предпочтительный объём фильтрата менее 5 мл; в противном случае необходимо пересмотреть выбор растворителя.
4. Рекомендуется деградация примерно на 10% (5–15%). Если образец не деградирует после погружения в кислоту или основание с концентрацией 2 моль/л при 90 °C в течение 12 часов, он считается стабильным и не требует дальнейшей деградации. Для порошка образца и раствора необходимо воздействие света интенсивностью 4500 люкс в течение 48 часов. После деградации pH раствора образца и холостого раствора следует привести в соответствие с pH подвижной фазы перед вводом, чтобы предотвратить неблагоприятное воздействие на колонку. Если деградация превышает 20%, условия деградации следует смягчить.
5. Разрешение должно быть достаточным, без помех для количественного определения, и каждый пик должен соответствовать требованиям чистоты отдельного пика.
6. Градиентный метод должен включать этап максимальной элюирующей способности, чтобы гарантировать, что все примеси элюируются и обнаруживаются.
7. Процесс исследования метода и экспериментов по оптимизации, как правило, не документируется, но отражается в лабораторном журнале. Если метод не разработан, необходимо задокументировать выбор градиента и длины волны.
8. Оптимизированный метод должен использоваться для анализа всех образцов в один и тот же день, одним и тем же лицом, с использованием одного и того же прибора для окончательной проверки, чтобы обеспечить сопоставимость.
9. Эксперименты по оптимизации метода следует проводить с использованием небольших лабораторных образцов после отладки производственного процесса. На ранних этапах синтеза исходного сырья для предварительного анализа примесей можно использовать элюирование в широком градиенте.

Операционные процедуры: Цель — проверить способность метода дифференцировать целевые компоненты и всесторонне оценить анализ примесей.

С помощью детектора DAD или подходящего универсального детектора проведите анализ исходных материалов, промежуточных продуктов, вспомогательных веществ и стандартных образцов примесей на содержание воды, кислоты (1 моль/л), основания, кислорода (10% перекиси водорода), воздействие света и высокотемпературную деградацию в течение одного дня. Результаты можно использовать для обоснования профиля примесей в документации к подаче.

Технические моменты:

1. Подготовьте деградированные образцы согласно вышеуказанной процедуре, включая холостые и отрицательные образцы.
2. Обеспечьте хорошее разделение без помех количественному определению и соответствие всех пиков требованиям к чистоте отдельного пика.
3. Градиентный метод должен включать этап максимальной элюирующей способности.
4. Все образцы должны быть проанализированы заранее определенным методом в один и тот же день, одним и тем же лицом и с использованием одного и того же прибора для сопоставимости.
5. Для нормативной документации данные в идеале следует получать по результатам валидации первой партии продукции.
6. Если хроматографические условия соответствуют методам тестирования на примеси, данные о специфичности могут быть переданы.
7. При подготовке документов хроматограмм необходимо включить УФ-спектр и графики пиковой чистоты основного компонента.

Порядок работы: применяется метод отношения сигнал/шум (S/N) — концентрация, при которой S/N ≥ 3, является пределом детектирования.

Технические моменты:

1. Сначала введите холостой раствор, затем концентрированный раствор сравнения (1 мг/мл). Определите уровень шума базовой линии в течение 1–2 минут при времени удерживания основного пика, измерьте высоту пика и рассчитайте предел обнаружения (LOD) как утроенную эту высоту.
2. Разбавьте исходный раствор до приблизительно рассчитанной концентрации.
3. Документация должна включать не менее трех хроматограмм (холостой растворитель, концентрированный раствор и разбавленный раствор).

Порядок работы: применяется метод отношения сигнал/шум (S/N) — концентрация, при которой S/N ≥ 10, является LOQ.

Технические моменты:

1. Рассчитайте LOQ как десятикратную высоту базового пика.
2. Разбавьте раствор LOD до расчетной концентрации LOQ и введите шесть раз, обеспечив относительное стандартное отклонение площади пика <2% (или до 5% при необходимости).
3. Документация должна включать шесть хроматограмм (разбавленные растворы из шести инъекций).
4. Для облегчения нормативного контроля LOD и LOQ следует определять в один и тот же день, используя одну и ту же шкалу вертикальной оси на хроматограммах.

Процедура эксплуатации: 5- или 7-точечная калибровочная кривая, в зависимости от необходимости.

Технические моменты:

1. Первая точка должна соответствовать концентрации LOQ, средняя точка — концентрации 100%, а последняя точка — концентрации 200% (приемлемо 160% или 180%).
2. Корректировка концентрации должна осуществляться путем разбавления, а не изменения объема инъекции.
3. Требуется коэффициент корреляции r > 0,999.
4. Калибровку следует проводить с использованием эталонных стандартов.
5. Максимальная концентрация, определяемая в ходе теста на извлечение, должна находиться в линейном диапазоне; в противном случае количественная оценка будет ненадёжной. Это распространённая ошибка.

Порядок работы: введите один и тот же раствор образца шесть раз подряд .

Технические моменты:

1. Рассчитайте RSD площади пика < 2%.
2. Документация должна включать семь хроматограмм (одну холостую, шесть вводов образцов).
3. Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.

Операционная процедура: проводится параллельно с испытаниями на прецизионность с четко спланированными временными интервалами. Хроматограммы для испытаний на стабильность и прецизионность, выполненные в одни и те же временные точки, можно использовать взаимозаменяемо для сокращения трудозатрат. Основные временные точки: 0, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24 часа (сокращение возможно только при наличии чётко документированных данных о стабильности).

Технические моменты:

1. Хроматограммы прецизионного теста можно использовать для оценки стабильности в течение 2 часов, 4 часов или даже 6 часов.
2. Сообщите данные для шести выбранных временных точек из 7–8 измеренных.
3. Данные о стабильности должны подтверждать стабильность препарата в течение как минимум 16 часов ; чем дольше, тем лучше. Автоматические инъекции в течение ночи могут длиться более 12 часов без какого-либо вмешательства человека. Если этот период слишком короткий, данных может быть недостаточно для подтверждения стабильности.
4. В особых случаях могут применяться альтернативные рабочие процедуры, такие как низкотемпературные автодозаторы, специальное хранение или свежеприготовленные растворы, но для их регистрации в методических стандартах они должны быть подтверждены подтверждающими данными.
5. Относительное стандартное отклонение площади пика по шести временным точкам должно быть <2%.

Процедура эксплуатации: Проведите анализ двух эталонных растворов и шести тестовых растворов из одной и той же партии одним и тем же аналитиком и одним и тем же методом, вводя каждый раствор один раз.

Технические моменты:

1. Относительное стандартное отклонение содержания < 2%.
2. Документация должна включать девять хроматограмм (одну пустую, две контрольные, шесть тестовых образцов).
3. Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.

Процедура: проводится в другой день другим аналитиком с использованием другого прибора по той же методике. Повторно проанализируйте два эталонных раствора и шесть испытуемых растворов . Стандартные образцы следует взвесить повторно.

Технические моменты:

1. Чтобы избежать проблем с вариацией показаний приборов, проводите промежуточную проверку точности на следующий день после выполнения других процедур, описанных выше.
2. Все 12 результатов содержания (повторяемость + промежуточная прецизионность) должны быть включены в расчеты с относительной стандартной погрешностью < 2%.
3. Документация должна включать 18 хроматограмм (9 — для повторяемости, 9 — для промежуточной прецизионности).
4. Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.

Процедура: Проведите тест на извлечение. Для нерасфасованных лекарственных средств (АФИ) применяется прямой коэффициент извлечения; для составов – повышенный коэффициент извлечения. Взвесьте образцы в пропорциях 80%, 100% и 120%, по 3 образца в каждом. Введите каждый образец один раз, используя один и тот же метод.

Технические моменты:

1. В качестве теоретического значения используйте среднее значение, полученное в результате испытаний на промежуточную точность.
2. Диапазон восстановления: 98%–102%, RSD < 2%.
3. Документация должна включать 12 хроматограмм (одну холостую, две контрольные, девять образцов). Нормативные данные должны быть получены в результате валидации первой партии продукции.
4. Для проведения теста на извлечение с добавлением добавки смешайте и измельчите не менее 20 дозированных единиц, затем добавьте добавку в образцы (взвешенные в пропорциях 80%, 100% и 120%) в соотношении 1:1.
5. Если вспомогательные вещества адсорбируются или мешают анализу, в результате чего скорость извлечения не соответствует требованиям, вместо этого можно использовать прямую регенерацию.

Переключатель колонок

Процедура:
Используйте колонки ВЭЖХ трех разных марок для сравнения эффективности разделения, времени удерживания и результатов анализа.

• Если в наличии недостаточно марок, используйте несколько партий одной или двух марок.
• Не используйте для тестирования испорченные или просроченные колонки.

Технические моменты:

• В идеале тест следует проводить в один и тот же день, используя два образца раствора и два контрольных раствора .
• Необходимо включить в общей сложности 15 хроматограмм из 3 колонок (одна пустая, два эталонных раствора и два раствора образца на колонку).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа по шести повторам (n=6) должно быть <2%.
• Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.

Соотношение подвижной фазы:

Процедура:
Измените нижний компонент подвижной фазы примерно на ±5%.

Технические моменты:

• В идеале тест следует проводить в один и тот же день, используя два образца раствора и два контрольных раствора .
• Необходимо включить в общей сложности 15 хроматограмм из 3 соотношений (один пустой раствор, два эталонных раствора и два раствора образца на каждое соотношение).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа по шести повторам (n=6) должно быть <2%.
• Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.
• Хроматограммы оптимального стандартного состояния необходимо пересчитывать ежедневно, чтобы подтвердить эффективность колонки и избежать неверной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

Изменение расхода:

Процедура:
Измените скорость потока на ±10%.

Технические моменты:

• В идеале тест следует проводить в один и тот же день, используя два образца раствора и два контрольных раствора .
• Необходимо включить в общей сложности 15 хроматограмм из 3 скоростей потока (одна холостая проба, два эталонных раствора и два раствора образца на каждую скорость потока).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа по шести повторам (n=6) должно быть <2%.
• Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.
• Хроматограммы оптимального стандартного состояния необходимо пересчитывать ежедневно, чтобы подтвердить эффективность колонки и избежать неверной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

Различные условия pH:

Процедура:
Отрегулируйте значение pH на ±0,2.

Технические моменты:

• В идеале тест следует проводить в один и тот же день, используя два образца раствора и два контрольных раствора .
• Необходимо включить в общей сложности 15 хроматограмм из 3 значений pH (один пустой раствор, два эталонных раствора и два раствора образца для каждого значения pH).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа по шести повторам (n=6) должно быть <2%.
• Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.
• Хроматограммы оптимального стандартного состояния необходимо пересчитывать ежедневно, чтобы подтвердить эффективность колонки и избежать неверной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

Температура колонки:

Процедура:
Изменяйте температуру колонки на ±5°C, проводя тестирование при 25°C, 30°C (или оптимальном параметре) и 35°C.

Технические моменты:

• В идеале тест следует проводить в один и тот же день, используя два образца раствора и два контрольных раствора .
• Необходимо включить в общей сложности 15 хроматограмм, полученных при трех температурах (одна холостая проба, два эталонных раствора и два раствора образца для каждой температуры).
• Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов анализа по шести повторам (n=6) должно быть <2%.
• Нормативные данные должны быть получены в результате проверки первой партии продукции.
• Хроматограммы оптимального стандартного состояния необходимо пересчитывать ежедневно, чтобы подтвердить эффективность колонки и избежать неверной интерпретации из-за деградации колонки или других проблем.

После завершения проверки метода и обеспечения соответствия всех параметров оценки требуемым стандартам проведите испытания на трех проверочных партиях продукции и эталонном продукте в тот же день.

• Эти данные будут включены в отчет о проверке продукции для представления регулирующим органам.
• Он также служит данными о стабильности на нулевой день.