Как рассчитать процент извлечения при анализе с добавкой в хроматографии
Введение
В аналитической химии процент извлечения при добавлении является фундаментальным параметром, используемым для оценки точности аналитического метода. Он отражает, насколько эффективно целевой аналит может быть извлечен из матрикса образца в течение всего процесса подготовки и анализа образца. В ВЭЖХ, ГХ, ЖХ-МС и других инструментальных методах анализа эксперименты по извлечению при добавлении широко применяются при валидации методов для проверки того, приводят ли процедуры экстракции, очистки и обнаружения образцов к значительным потерям аналита или матричным помехам.
Что такое процент извлечения при добавлении?
Процент извлечения при добавлении – это отношение измеренного количества целевого соединения, извлеченного из образца после добавления известного количества стандартного вещества, к теоретическому количеству, которое было добавлено.
В типичном эксперименте по извлечению известное количество стандарта аналита добавляется в матрикс образца, и обогащенный образец обрабатывается с использованием тех же процедур предварительной подготовки и анализа, что и фактический образец. Измеренный результат затем сравнивается с теоретически добавленным количеством для расчета процента извлечения. Формула для расчета процента извлечения при добавлении: P (%) = [(Значение обогащенного образца – Значение образца) / Значение добавки] × 100%.
Процент извлечения, близкий к 100%, указывает на то, что аналитический метод может точно извлекать и определять целевой аналит из матрикса образца.
Три вида извлечения при добавлении
Контекст эксперимента диктует тип используемого теста. В целом, эксперименты по извлечению при добавлении можно разделить на три категории.
Извлечение при добавлении в холостую пробу: В этом типе теста используется холостой матрикс (образец, который вообще не содержит целевого аналита). Известное количество стандартного вещества добавляется в этот холостой образец и проходит все этапы анализа. Отношение измеренного аналита к теоретической добавленной массе определяет процент извлечения в холостой пробе. Он в основном используется для оценки точности самой аналитической процедуры.
Извлечение при добавлении в отрицательную пробу: Отрицательная проба — это матрикс образца, который не содержит определяемых уровней целевого аналита. В этом типе теста готовятся две идентичные порции отрицательной пробы: одна из них анализируется непосредственно без добавления стандартного вещества, а другая обогащается известным количеством целевого стандартного вещества. Оба образца анализируются в идентичных условиях. Извлечение рассчитывается путем вычитания отклика контрольной пробы из отклика обогащенной пробы, затем деления на теоретически добавленное количество.
Извлечение при добавлении в положительную пробу: Положительная проба уже содержит определенное количество целевого аналита. Процедура аналогична обогащению отрицательной пробы, но первоначальная концентрация аналита в образце должна быть определена предварительным анализом. Затем выбирается количество добавки (которое обычно эквивалентно исходной концентрации).
Практические рекомендации для достоверного эксперимента по извлечению при добавлении
Наиболее распространенные ошибки в экспериментах по извлечению заключаются не в расчетах, а в физическом выполнении. Ниже приведены некоторые общие рекомендации для получения точных, надежных данных по извлечению.
- Совместите физическую и химическую формы добавленного стандарта и целевого аналита.
- Совместите количество добавки с содержанием в образце. Как правило, количество добавки в массе составляет от 0,5 до 2 раз от исходной массы аналита и не превышает 3 раз. Концентрация после добавления не должна превышать верхний предел метода. Если исходная концентрация образца ниже предела обнаружения (LOD), добавляйте на уровне LOD.
- Сделайте концентрацию добавки высокой, а объем как можно меньшим. Объем раствора добавки не должен превышать 1% от исходного объема образца. Если концентрация аналита в образце близка к LOD метода, уровень добавки должен быть ограничен низким диапазоном концентраций калибровочной кривой.
- После добавления измеренная концентрация не должна превышать 90% от верхнего предела аналитического метода.
Расчет требуемого количества добавки
Предположим, мы работаем с методом, предварительная обработка образцов которого осуществляется следующим образом: Взвесить 5 ± 0,01 г образца, поместить в центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавить 10 мл ацетонитрила, вихревать 2 минуты, обрабатывать ультразвуком 15 минут и центрифугировать при 4000 об/мин, 4 °C в течение 5 минут. Перенести супернатант в колориметрическую пробирку объемом 25 мл и экстрагировать остаток еще 10 мл ацетонитрила. Объединить экстракт в колориметрической пробирке и разбавить ацетонитрилом до метки. Хорошо перемешать. Измерить 5 мл экстракта через патрон ТФЭ, собрать элюат, выпарить азотом на водяной бане при 40 °C досуха, разбавить до 1 мл метанолом и отфильтровать через мембрану 0,22 мкм.
Предположим, что конечная требуемая инструментальная концентрация составляет 10 нг/мл, а исходный стандартный раствор целевого аналита имеет концентрацию 1 мг/л. Как рассчитать требуемое количество добавки?
- Шаг 1: Определить конечное количество. Конечный объем раствора перед инжекцией составляет 1 мл, поэтому количество аналита, необходимое в конечном растворе, равно n = C × V = 10 нг/мл × 1 мл = 10 нг.
- Шаг 2: Рассчитать количество до разбавления во время пробоподготовки. Только 5 мл из 25 мл объема экстракта берется для очистки ТФЭ. То есть только 5 мл/25 мл = 1/5 экстрагированного аналита попадает в конечный раствор. Следовательно, первоначально добавленный стандарт в 5 раз превышает конечное количество: 10 нг × 5 = 50 нг.
- Шаг 3: Рассчитать требуемый объем стандартного раствора. Концентрация исходного стандартного раствора составляет 1 мг/л, или 1000 нг/мл. Следовательно, требуемый объем составляет V = n / C = 50 нг / 1000 нг/мл = 0,05 мл = 50 мкл.
В практических расчетах следует использовать точное значение веса образца вместо номинальных 5 г. Кроме того, при расчете следует учитывать и корректировать чистоту стандартного вещества.