Рекомендации по использованию подвижных фаз в ВЭЖХ: приготовление, использование и хранение
Введение
Подвижная фаза играет важнейшую роль в анализах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Идеальный растворитель для подвижной фазы ВЭЖХ должен обладать низкой вязкостью, хорошей химической совместимостью как с неподвижной фазой, так и с детектором, низкой токсичностью, а также разумной стоимостью и доступностью.
Несмотря на свою важность, подвижная фаза часто игнорируется, и, казалось бы, незначительные ошибки при её приготовлении, обращении или хранении могут привести к неожиданным отклонениям в экспериментальных результатах. Поэтому правильное управление подвижной фазой имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости метода и стабильности системы, а также для продления срока службы как колонки, так и прибора.
Выбор и состав подвижных фаз
В зависимости от системы и самого анализа следует выбирать различные подвижные фазы. В системах обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ЖХ) наиболее часто используются смеси метанол-вода и ацетонитрил-вода.
- Если УФ-детектирование проводится на низких длинах волн, то обычно предпочтительнее использовать ацетонитрил-воду из-за его более низкого поглощения УФ-излучения.
- Если требуется буфер, то концентрация буферной соли должна быть низкой, чтобы свести к минимуму загрязнение колонки и износ прибора.
- Если используются колонки с силикагелем, связанным по C18 , то содержание органики в подвижной фазе не должно быть ниже 5% для поддержания эффективности колонки и обеспечения стабильности системы.
В нормально-фазовых системах в качестве подвижных фаз обычно используют комбинацию двух или более органических растворителей (например, дихлорметана и гексана).
Подвижные фазы могут использоваться как в изократическом, так и в градиентном режиме элюирования. При использовании градиентного элюирования необходимо четко определить программу градиента, подробно описывающую состав растворителей с течением времени, обычно документированную в табличном формате.
Приготовление подвижных фаз
1. Выбор растворителей
При выборе растворителей для подвижной фазы аналитикам следует руководствоваться следующими рекомендациями:
- Выбирайте растворители с умеренной температурой кипения, чтобы избежать чрезмерного испарения и образования пузырьков.
- Обеспечьте как физическую, так и химическую совместимость с детектором; при использовании УФ-детектора идеальными будут растворители с низким поглощением УФ-излучения.
- Подвижная фаза должна адекватно растворять все компоненты образца, чтобы предотвратить образование осадка или необратимое удерживание на колонке.
- Используйте растворители с низкой вязкостью для улучшения разрешения, снижения противодавления в системе и продления срока службы насоса.
- Подвижная фаза не должна реагировать с аналитом и разрушать неподвижную фазу.
- При препаративном разделении растворители должны легко удаляться, не мешая извлечению целевого соединения.
2. Протоколы в стадии подготовки
- При смешивании органических растворителей с водными буферными растворами всегда добавляйте органический растворитель в буферный раствор, чтобы снизить риск выпадения солей в осадок.
- При использовании изократических методов органическую и водную фазы необходимо тщательно перемешать перед использованием.
- Выберите подходящую буферную систему и точно отрегулируйте pH.
- Дегазируйте и отфильтруйте подвижную фазу, используя подходящие методы, такие как нагревание, вакуум, ультразвуковая обработка или барботирование гелием.
Правильное обращение с подвижными фазами во время использования
- Подвижные фазы следует по возможности готовить свежими, особенно те, которые содержат буферные соли, склонные к росту микроорганизмов. Избегайте длительного хранения.
- Никогда не доливайте в подвижную фазу свежеприготовленную партию. Всегда заменяйте весь объём для поддержания однородности.
- Избегайте использования лабораторных герметизирующих плёнок для герметичной герметизации бутылок. Вместо этого используйте специальные крышки с односторонним вентилированием для обеспечения безопасного газообмена.
- Перед использованием всегда дайте охлажденным подвижным фазам нагреться до комнатной температуры.
- По возможности избегайте использования моющих средств на основе поверхностно-активных веществ при очистке контейнеров с подвижной фазой.
- Установите минимальные пороговые значения давления или оповещения о минимальном объеме растворителя, чтобы не допустить работы системы всухую.
- При использовании буферизованных подвижных фаз активируйте функцию промывки плунжера или вручную промывайте головки насоса после использования, чтобы предотвратить накопление солей.
Хранение мобильной фазы
- Подвижные фазы следует хранить в стеклянных или ПТФЭ-емкостях; также можно использовать емкости из нержавеющей стали. Никогда не храните подвижные фазы в пластиковых емкостях из-за риска выщелачивания пластификаторов в органические растворители.
- Все контейнеры должны быть плотно закрыты, чтобы предотвратить испарение растворителя, поскольку это может изменить состав, а также свести к минимуму поглощение кислорода и углекислого газа, влияющих на уровень pH.
- Фосфатные и ацетатные буферные растворы следует готовить свежими, поскольку они подвержены росту микроорганизмов и разложению. В случае необходимости хранения их следует хранить в холодильнике не более 3 дней и повторно фильтровать перед использованием.
- Подготовленные подвижные фазы следует плотно закрыть, чтобы избежать улетучивания и загрязнения, и четко промаркировать с указанием состава растворителя, соотношения, даты приготовления и срока годности.
- Светочувствительные растворители следует хранить в бутылках из янтарного стекла, чтобы защитить их от разложения.
- Галогенированные растворители следует использовать с осторожностью. Они могут содержать кислотные примеси, поэтому могут вызывать коррозию деталей из нержавеющей стали и разлагаться при контакте с водой. Избегайте длительного хранения смесей галогенированных растворителей или готовьте их свежими перед использованием.
Заключение
Эффективное управление подвижными фазами критически важно для успеха ВЭЖХ-анализа. Аналитикам следует всегда уделять особое внимание правильному выбору растворителя, подготовке, обращению и хранению подвижных фаз, а также избегать распространённых ошибок, перечисленных в этой статье, для достижения точных и стабильных результатов эксперимента.