Рекомендации по использованию подвижных фаз в ВЭЖХ: приготовление, использование и хранение
Введение
Подвижная фаза играет критическую роль в анализах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Идеальный растворитель подвижной фазы ВЭЖХ должен обладать низкой вязкостью, хорошей химической совместимостью как со стационарной фазой, так и с детектором, низкой токсичностью, а также быть доступным по разумной цене.
Несмотря на свою важность, подвижная фаза часто недооценивается, и, казалось бы, незначительные ошибки в ее приготовлении, обращении или хранении могут привести к неожиданным отклонениям в экспериментальных результатах. Поэтому правильное управление подвижной фазой необходимо для обеспечения воспроизводимости метода и стабильности системы, а также для продления срока службы как колонки, так и прибора.
Выбор и состав подвижных фаз
В зависимости от системы и самого анализа следует выбирать различные подвижные фазы. В системах ВЭЖХ с обращенной фазой (RP-LC) наиболее часто используются подвижные фазы метанол-вода и ацетонитрил-вода.
- Если УФ-детектирование выполняется при низких длинах волн, обычно предпочтительнее ацетонитрил-вода из-за ее более низкого УФ-поглощения.
- Если требуется буфер, то концентрация буферной соли должна быть низкой, чтобы минимизировать загрязнение колонки и износ прибора.
- Если используются колонки с привитым С18 силикагелем, то содержание органического компонента в подвижной фазе не должно опускаться ниже 5% для поддержания эффективности колонки и обеспечения стабильности системы.
В нормально-фазовых системах в качестве подвижных фаз обычно используется комбинация двух или более органических растворителей (например, дихлорметана и гексана).
Подвижные фазы могут подаваться как в изократическом, так и в градиентном режимах элюирования. При использовании градиентного элюирования должна быть четко определена градиентная программа, детализирующая состав растворителей во времени, обычно документируемая в табличном формате.
Приготовление подвижных фаз
1. Выбор растворителей
При выборе растворителей для подвижной фазы аналитикам следует придерживаться следующих рекомендаций:
- Выбирайте растворители с умеренными температурами кипения, чтобы избежать чрезмерного испарения и образования пузырьков.
- Обеспечьте физическую и химическую совместимость с детектором; при использовании УФ-детектора идеальны растворители с низким УФ-поглощением.
- Подвижная фаза должна адекватно растворять все компоненты образца, чтобы предотвратить осаждение или необратимое удерживание на колонке.
- Используйте растворители с низкой вязкостью для улучшения разрешения, снижения противодавления в системе и продления срока службы насоса.
- Подвижная фаза не должна реагировать с аналитом и не должна разрушать стационарную фазу.
- При препаративных разделениях растворители должны легко удаляться, не мешая извлечению целевого соединения.
2. Протоколы подготовки
- При смешивании органических растворителей с водными буферами всегда добавляйте органический растворитель к буферному раствору, чтобы снизить риск осаждения солей.
- Для изократических методов тщательно предварительно смешайте органическую и водную фазы перед использованием.
- Выберите подходящую буферную систему и точно отрегулируйте pH.
- Дегазируйте и фильтруйте подвижную фазу, используя подходящие методы, такие как нагревание, вакуум, ультразвуковая обработка или продувка гелием.
Правильное обращение с подвижными фазами во время использования
- Подвижные фазы следует готовить непосредственно перед использованием, особенно те, которые содержат буферные соли, склонные к микробному росту. Избегайте длительного хранения.
- Никогда не "доливайте" свежеприготовленную порцию к существующей подвижной фазе. Всегда заменяйте весь объем для поддержания однородности.
- Избегайте использования лабораторных уплотнительных пленок для герметизации бутылей. Вместо этого используйте специальные односторонние вентилируемые крышки для бутылей, чтобы обеспечить безопасный газообмен.
- Всегда дайте охлажденным подвижным фазам достичь комнатной температуры перед использованием.
- По возможности избегайте использования моющих средств на основе поверхностно-активных веществ при очистке контейнеров для подвижной фазы.
- Установите минимальные пороговые значения давления или оповещения о минимальном объеме растворителя, чтобы предотвратить работу системы "всухую".
- При использовании буферных подвижных фаз активируйте функцию промывки плунжера или вручную промойте головки насоса после использования, чтобы предотвратить образование солей.
Хранение подвижной фазы
- Подвижные фазы следует хранить в стеклянных или ПТФЭ контейнерах; также могут использоваться контейнеры из нержавеющей стали. Никогда не храните подвижные фазы в пластиковых контейнерах из-за риска выщелачивания пластификаторов в органические растворители.
- Все контейнеры должны быть плотно закрыты, чтобы предотвратить испарение растворителя, так как это может изменить состав, и минимизировать поглощение кислорода и углекислого газа, влияющее на уровни pH.
- Растворы фосфатного и ацетатного буферов следует готовить непосредственно перед использованием, так как они склонны к микробному росту и разложению. Если они хранятся, то не более 3 дней в холодильнике и должны быть повторно отфильтрованы перед использованием.
- Приготовленные подвижные фазы должны быть плотно запечатаны, чтобы избежать улетучивания и загрязнения, и четко помечены составом растворителя, соотношением, датой приготовления и сроком годности.
- Светочувствительные растворители следует хранить в янтарных бутылях для защиты от разложения.
- Галогенированные растворители следует использовать с осторожностью. Они могут содержать кислотные примеси, поэтому вызывают коррозию компонентов из нержавеющей стали и разлагаются при контакте с водой. Избегайте длительного хранения смесей галогенированных растворителей или готовьте их непосредственно перед использованием.
Заключение
Эффективное управление подвижными фазами критически важно для успешного проведения анализов ВЭЖХ. Аналитикам всегда следует уделять особое внимание правильному выбору, приготовлению, обращению и хранению подвижных фаз, а также избегать распространенных ошибок, перечисленных в этой статье, для достижения точных и стабильных результатов экспериментов.