Метод разделения белка
Белки существуют в тканях и клетках в виде сложных смесей, и каждый тип клеток содержит тысячи различных белков. Однако до сих пор не существует единого метода, позволяющего выделить любой тип белка из этой сложной смеси. Здесь мы хотели бы поделиться с вами популярными в настоящее время методами разделения белков.
Метод разделения белков по их растворимости
01 Высаливание белка
Насыщенность соли, необходимая для высаливания различных белков, различна, поэтому целевой белок можно высаливать с осаждением, регулируя концентрацию соли. Эти белки сохраняют свои природные свойства и могут быть растворены без денатурации. Нейтральная соль (обычно сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, хлорид натрия, фосфат натрия. Сульфат аммония, как наиболее используемая соль, обладает преимуществом малого температурного коэффициента и высокой растворимости, а также не склонна к дегенерации) оказывает значительное влияние на растворимость белка. Как правило, его растворимость увеличивается с ростом концентрации соли при низкой концентрации соли, что называется солевой ванной. При дальнейшем росте концентрации соли растворимость осажденного белка последовательно падает в разной степени, это явление называется высаливанием. При добавлении большого количества соли в раствор белка ионы соли высокой концентрации (например, сульфат аммония SO₂ и NH₂) обладают сильной гидратационной силой и могут захватывать гидратный слой молекул белка, поэтому коллоидные частицы белка коагулируют и выпадают в осадок из-за потери воды.
Факторы, влияющие на высаливание, включают:
Температура: Обычно это можно сделать при комнатной температуре, за исключением низких температур (4 градуса) для термочувствительных белков. Как правило, растворимость белков снижается при низкой температуре, но некоторые белки (например, гемоглобин, миоглобин, альбумин) менее растворимы при более высоких температурах (25 градусов), чем при 0 градусах, и с большей вероятностью высаливаются.
pH: Большинство белков имеют самую низкую растворимость в концентрированных солевых растворах в изоэлектрических точках.
Концентрация белка: При высокой концентрации белка разделяемые белки часто осаждаются вместе с другими белками (явление соосаждения). Поэтому перед высаливанием сыворотку следует разбавить тем же количеством физиологического раствора, чтобы поддерживать содержание белка на уровне 2,5–3,0%.
После разделения белков высаливанием и осаждением необходимо удалить из них соль. Наиболее распространённый метод — диализ: раствор белка помещают в диализный мешок (обычно целлофановый) и проводят диализ с буферным раствором, постоянно его меняя. Диализ занимает много времени, поэтому его лучше проводить при низкой температуре. Кроме того, для удаления соли можно использовать гель декстрана Tandex G-25F или Tandex G-50, что занимает относительно немного времени.
02 Метод осаждения в изоэлектрической точке
Когда белок находится в статическом состоянии, сила электростатического отталкивания между частицами минимальна, поэтому растворимость минимальна. Изоэлектрическая точка различных белков различна, поэтому, регулируя pH раствора, можно достичь изоэлектрической точки белка и осадить его. Однако этот метод редко применяется самостоятельно, его можно использовать в сочетании с методом высаливания.
03 Метод низкотемпературного осаждения органическим растворителем
Большинство белков можно высаливать, уменьшая их растворимость в органическом растворителе, таком как метанол, этанол или ацетон, который может смешиваться с водой. Разрешающая способность этого метода выше, чем при высаливании, но для белков характерна денатурация, поэтому этот метод следует проводить при низкой температуре.
Метод разделения белков по размеру молекул
01 Диализ и ультрафильтрация
При диализе используются полупроницаемые мембраны для разделения белков разных молекулярных размеров.
Ультрафильтрация использует высокое давление или центробежную силу для проталкивания воды и других небольших молекул растворенных веществ через полупроницаемую мембрану, в то время как белки остаются на мембране. Для удержания белков с разной молекулярной массой можно выбрать различные размеры пор.
02 Метод гель-фильтрации
Также известная как молекулярно-эксклюзионная хроматография или хроматография на молекулярных ситах, это один из наиболее эффективных методов разделения белковых смесей по размеру молекул. В качестве наполнителей для колонки чаще всего используются декстрановый гель (серия Tandex), агарозный гель (серия Tanrose) и агарозный гель (серия SuperTandex pg).
Методы разделения белков по их заряженным свойствам
01 Электрофорез
Белки можно разделить по их подвижности в электрическом поле, определяемой их молекулярной массой и зарядом при одинаковом значении pH. В изоэлектрофокусированном электрофорезе в качестве носителя используется амфолит, который формирует градиент pH, постепенно увеличивающийся от положительного полюса к отрицательному. При достижении определённого уровня pH электрофорез прекращается.
02 Ионообменная хроматография
Ионообменные реагенты можно разделить на катионообменные реагенты (например, SP Tanrose 6 FF) и анионообменные реагенты Tanrose 6 FF (Q). Когда белковый раствор протекает через ионообменную хроматографическую колонку, белки с противоположным зарядом ионообменного реагента адсорбируются на ионообменном реагенте, затем белки можно элюировать, изменяя pH или ионную силу.
Метод разделения по лигандной специфичности – аффинная хроматография
03 Аффинная хроматография
Чрезвычайно эффективным методом разделения белков является их связывание с лигандом, специфичное, но не ковалентное. Для выделения очищаемого белка из сложной белковой смеси с высокой чистотой часто достаточно всего одного этапа.
Если у вас возникли проблемы или вам нужна дополнительная информация, свяжитесь с нами по адресу info@welchmat.com.