Очистка белка с His-меткой с помощью Ni-колонки – это так просто!

Введение

В 1975 году Порат и соавторы предложили новый метод очистки — хроматографию с иммобилизованными металлами-хелатами. Этот метод использует координационно-хелатное взаимодействие ионов металлов (Ni2+, Cu2+ и др.) с остатками на поверхности аминокислот (например, имидазолильной группой гистидина) для очистки белков, обладающих сродством к ионам металлов.

Гистидиновая метка широко используется, поскольку имеет небольшую молекулярную массу и практически не влияет на функцию, активность и структуру целевого белка. Аффинная хроматография с фиксированными ионами металлов является наиболее распространённым методом очистки белков, меченных гистидином.

Инструмент для очистки белков, меченных гистидином

Welch Ni Tanrose 6FF(NTA)

Среда Ni Tanrose 6FF (NTA) представляет собой среду для аффинной хроматографии, образуемую путем хелатирования Ni2+ на 6%-ном высокосшитом агарозном геле с использованием нитрилотриуксусной кислоты в качестве лиганда. Среда Welch Ni Tanrose 6FF (NTA) отличается высокой чистотой: общая ёмкость может достигать ~40 мг His-тега белка/мл благодаря контролю над разумной плотностью ионов Ni. Её можно использовать для очистки белков с гистидином (6xHis-тегом) из различных источников экспрессии (таких как E. coli, дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих). NTA содержит четыре хелатирующие зоны, которые связывают Ni2+ лучше, чем обычный тридентатный хелатирующий агент. 6xHis может быть хелатирован с Ni2+, так что His-меченый белок связывается с очищающей средой Ni Tanrose 6FF (NTA), несвязанный белок промывается, а белок, связанный со средой, мягко элюируется определенной концентрацией имидазола или буфером с низким pH, чтобы получить целевой белок с высокой чистотой.

Его преимуществами являются высокая нагрузочная способность, хорошая селективность, простота регенерации и низкая стоимость.

PreCot Ni 6FF (NTA) — это предварительно упакованная колонка Ni Tanrose 6FF (NTA) (1 мл и 5 мл), которую можно использовать для очистки белка, меченного 6xHis, с помощью шприца, перистальтического насоса или системы жидкостной хроматографии (например, AKTA или FPLC).

Приложение

Предварительно упакованная колонка: PreCot Ni 6FF (NTA) 5 мл.

Образец: His-меченый белок (экспрессия E. coli)

Равновесный раствор A: 50 мМ трис-HCl, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0

Элюент B: 50 мМ трис-HCl, 0,5 м NaCl, 0,5 м имидазол, pH 8,0

Скорость потока: равновесие и элюирование - 1,0 мл/мин, загрузка образца - 0,5 мл/мин

Примечание :

1-3: отсутствие имидазола в образце и равновесном растворе

4-6: 20 мМ имидазола в образце и равновесном растворе

Поскольку аминокислотные остатки гистидина и/или цистеина также присутствуют в белках-хозяевах, другие неспецифические белки и целевые белки связываются с аффинной хроматографической средой на ионах металлов, что приводит к низкой чистоте очищенных образцов. Увеличивая концентрацию имидазола в образце, можно очистить белок, меченный гистидином, с помощью Ni Tanrose 6FF (NTA) в один этап, получив очищенный образец с чистотой более 85%.

• 

•