Проточная ячейка в ВЭЖХ: маленький компонент с большими последствиями
Содержание
Введение
В рутинном жидкостно-хроматографическом (ЖХ) анализе мы часто уделяем наибольшее внимание скринингу колонок, составу подвижной фазы и оптимизации градиента. Однако проточная кювета, основной компонент детектора, часто остается без внимания, несмотря на ее существенное влияние.
В этой статье мы рассмотрим этот незаметный, но критически важный компонент.
Практические примеры: как проточная кювета может "испортить" ваш эксперимент
Случай 1: Проблема с плоской вершиной пика
Пользователь А (университет) столкнулся с постоянными пиками с плоской вершиной на аналитической ЖХ-системе Sail1000 10 мл из-за сильного поглощения УФ-излучения аналитом, что делало количественное определение невозможным. Замена стандартной проточной кюветы с длиной оптического пути 10 мм на вариант с 2 мм решила эту проблему.
(Метод пользователя является секретным, поэтому условия эксперимента и хроматограммы здесь не отображаются.)
Случай 2: Проблема с очисткой
Пользователь Б (фармацевтическая компания) столкнулся с перегрузкой образца на системе очистки EasyPure800 для очисток со средним и низким давлением. Без уменьшения количества инжекции, изменение проточной кюветы с длиной оптического пути 1 мм на 0,3 мм устранило проблему перегрузки и улучшило пропускную способность работы.
(Метод пользователя также является секретным, поэтому условия эксперимента и хроматограммы здесь не отображаются.)
Инженеры Welch Materials протестировали стандартный образец на обеих длинах оптического пути в условиях пользователя Б, и результаты следующие:
Случай 3: Различия между приборами одной модели
Пользователь онлайн поделился экспериментом, в котором образцы одинаковой концентрации давали заметно отличающиеся отклики детектора на двух приборах одной модели; устранение неисправностей показало, что два прибора были оснащены разными проточными кюветами.
| Прибор | Высота пика | Площадь пика | Проточная кювета |
| A | 942.18 | 6174.7 | Объем кюветы: 5 мкл Длина оптического пути: 6 мм |
| B | 1567.13 | 9666.86 | Объем кюветы: 10 мкл Длина оптического пути: 10 мм |
Все проблемы трех пользователей сводились к проточной кювете. Какие секреты хранит этот маленький компонент?
Что такое проточная кювета и какие ее параметры важны
Проточная кювета — это "глаз" УФ-детектора, оптическое окно, через которое проходит и детектируется образец. Основные параметры проточной кюветы включают:
- Длина оптического пути: определяет чувствительность в соответствии с законом Бера-Ламберта; большая длина оптического пути обеспечивает более высокую чувствительность.
- Объем: напрямую влияет на внеколоночное уширение пика. Чрезмерный объем может привести к повторному смешиванию уже разделенных пиков внутри детектора, что вызовет уширение пика и снижение эффективности колонки.
- Допустимое давление: проточная кювета, способная выдерживать высокое давление, необходима, особенно при использовании колонок с мелкими частицами или подвижных фаз высокой вязкости.
- Материал окна: обычно кварц, применимый для УФ-видимого спектрального диапазона.
Выбор проточной кюветы
Выбор проточных кювет должен основываться на внутреннем диаметре (ВНД) колонки. Обычно, чем меньше ВНД колонки, тем меньше должен быть объем проточной кюветы. Если проточная кювета слишком велика относительно колонки, возникает эффект накопления растворителя, когда образец переходит из колонки в проточную кювету, что приводит к значительному влиянию внеколоночного объема, отрицательно сказывающемуся на разделении.
При выборе объема проточной кюветы относительно колонки и прибора, практическое руководство состоит в том, чтобы выбрать объем проточной кюветы менее одной десятой (1/10) объема элюции самого раннего (мертвого времени) хроматографического пика.
Помимо того, чтобы объем был как можно меньше, при выборе следует отдавать предпочтение проточным кюветам, которые имеют максимально возможную оптическую длину пути.
Как проточные кюветы влияют на анализы
В целом, более крупные проточные кюветы обеспечивают лучшие пределы обнаружения (LOD), тогда как меньшие проточные кюветы дают лучшее разрешение пиков.
Крупная проточная кювета собирает больший световой поток и — благодаря более длинному оптическому пути — производит более сильный сигнал на фотодетекторе. Это увеличивает чувствительность и, как следствие, улучшает предел обнаружения.
Меньшие проточные кюветы, хотя и получают меньший световой поток, имеют меньшие внутренние размеры и более короткий оптический путь, что уменьшает диффузию внутри кюветы и, как следствие, улучшает разрешение пиков.
Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера:
Абсорбция = − log T = log (l₀/l) = ε × C × d
Чем длиннее оптический путь, тем выше интенсивность сигнала. Поскольку шум обычно не увеличивается значительно с длиной пути, отношение сигнал/шум улучшается. Например, когда длина пути увеличивается с 6 мм до 10 мм, шум увеличивается лишь менее чем на 10%, в то время как интенсивность сигнала увеличивается примерно на 70%.
Увеличение длины оптического пути часто приводит к увеличению объема проточной кюветы (в приведенном выше примере объем увеличивается с 5 мкл до 14 мкл). Это увеличение, вероятно, приводит к некоторому рассеянию пика, но в большинстве случаев не снижает разрешение при градиентных разделениях.
Применение: Максимизация чувствительности при анализе афлатоксинов с помощью правильно подобранных проточных кювет
Для демонстрации вышеуказанных выводов рассмотрим следующий положительный пример. Анализ афлатоксинов традиционно требует сложной предколоночной или постколоночной дериватизации для усиления флуоресценции. Однако в двух приведенных ниже примерах исследователи использовали проточные кюветы большого объема, обходясь без трудоемкой и опасной предколоночной дериватизации и специализированного оборудования, необходимого для постколоночной дериватизации, и все же добились усиления сигнала.
Случай 1
Условия:
- Колонка: Waters Acquity BEH C18 (2,1 мм × 100 мм, 1,7 мкм)
- Подвижная фаза:
A: метанол : ацетонитрил = 50 : 50 (об./об.)
B: вода
A : B = 36 : 64 (об./об.) - Скорость потока: 0,3 мл/мин
- Температура колонки: 40 °C
- Объем инжекции: 10 мкл
- Флуоресцентный детектор: возбуждение 365 нм, эмиссия 450 нм
В идентичных условиях сравнение обычной проточной кюветы (2 мкл) и проточной кюветы большого объема (13 мкл) для реакции на афлатоксин показывает, что кювета большого объема дала существенно более высокий отклик. Чувствительность для афлатоксинов B2 и G2 увеличилась более чем в пять раз; более того, интенсивность сигнала для афлатоксинов B1 и G1 увеличилась примерно в двадцать раз. Поэтому для этого анализа была выбрана проточная кювета большого объема для флуоресцентного детектора.
Из хроматограммы также видно, что использование большой проточной кюветы увеличивает внеколоночные объемные эффекты, что приводит к некоторому расплыванию пика.
Случай 2
Колонки UPLC элюируют быстрее, чем колонки HPLC, значительно сокращая время анализа и повышая эффективность разделения. Таблица 1 показывает, что снижение скорости потока может увеличить чувствительность, но низкие скорости потока увеличивают время выполнения и могут снизить эффективность.
Поэтому в этом анализе для колонки HPLC была выбрана скорость потока, рекомендованная производителем колонки (1,0 мл/мин), а для колонки UPLC — 0,3 мл/мин. Более низкая скорость потока UPLC снижает потребление подвижной фазы и обеспечивает очевидную экономию реагентов.
Для аналитов со слабой абсорбцией выбор проточной кюветы с большей длиной пути может увеличить силу сигнала, улучшая чувствительность детектора и давая лучшие результаты.
Для аналитов с сильной абсорбцией рекомендуются проточные кюветы с меньшей длиной пути, поскольку они лучше предотвращают превышение сигналом линейного диапазона детектора, что позволяет увеличивать загрузку образца при препаративной работе.
(Часть материалов и изображений, использованных в этой статье, была получена из Интернета, литературы и руководства пользователя Agilent. Они предоставлены исключительно для обсуждения и некоммерческого использования. Пожалуйста, оценивайте и ссылайтесь на них соответствующим образом.)
Ссылки
[1] HU Jiawei et. al. Определение 4 афлатоксинов в пищевых продуктах с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии и флуориметрического детектирования в сочетании с проточной кюветой большого объема. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2017, 27(8): 1109-1111.
[2] WANG Junlin et. al. Определение афлатоксина M1 в молоке с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии и флуориметрического детектирования в сочетании с проточной кюветой большого объема. Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences), 2013, 39(2): 191-196.