[Взгляд читателей] Почему возникают М-образные пики?

При хроматографическом анализе часто встречается досадная проблема при интерпретации хроматограмм — появление M-образных пиков. Даже стандартные образцы могут демонстрировать это явление, однако его причина часто остается неясной. Корректировка подвижной фазы или замена колонки могут помочь незначительно или не помочь вовсе, что приводит аналитиков в замешательство.

В этой статье мы рассмотрим причины появления M-образных пиков и соответствующие методы устранения, исходя из личного опыта и точки зрения автора.

Влияние растворителя возникает, когда разница полярностей между разбавителем (растворителем для восстановления) и подвижной фазой слишком велика.

В системах с обращенной фазой подвижная фаза обычно относительно полярна, тогда как разбавитель, часто представляющий собой чистый метанол или чистый ацетонитрил, менее полярен. Во время элюирования предпочтительно элюируется внешняя часть впрыскиваемой капли, что приводит к «более быстрому элюированию» части аналита, что в конечном итоге приводит к образованию M-образного пика.

В этом случае можно добавить определенную долю воды к разбавителю для увеличения его полярности или использовать подвижную фазу в качестве разбавителя напрямую. Если обе операции затруднены, уменьшение объема впрыска также может улучшить ситуацию.

Эта ситуация чаще встречается для кислотно-основных или солевых соединений, таких как бензойная кислота, сорбиновая кислота, меламин и некоторые синтетические красители. Такие соединения могут одновременно существовать в ионизированной и нейтральной формах при определенных условиях pH, что приводит к различному взаимодействию со стационарной и подвижной фазами и, таким образом, к различиям во времени удерживания, образуя M-образный пик.

В таких случаях регулирование pH подвижной фазы или добавление буферных солей для поддержания аналита в одной форме может решить проблему.

Изомеры обычно классифицируются как изомеры функциональных групп, позиционные изомеры, цис-транс изомеры и стереоизомеры (хиральные изомеры), среди прочих менее распространенных типов. Изомерные ситуации трудно разрешить, поскольку структуры схожи и их трудно различить по спектру или молекулярной массе, поэтому для разделения обычно требуется хроматография.

В случае изомеров можно попытаться разделить их, корректируя программу градиентного элюирования; если это все еще неудовлетворительно и нет строгих требований к различению отдельных изомеров, увеличение доли органического модификатора в подвижной фазе для ускорения элюирования аналита может сжать M-образный пик в единый пик для количественной оценки.

Например, в национальном стандарте GB 5009.35-2016 «Определение синтетических красителей в пищевых продуктах» Brilliant Blue, хотя и имеющий две формы в своем стандартном материале, имел только один пик в стандартном методе (только в более поздней редакции, GB 5009.35-2023, эти два пика разделены).

В условиях элюирования по данному методу они не разделяются; но на практике, если немного замедлить изменение градиента, они начинают разделяться. Более того, полное разделение этих пиков затруднено и имеет ограниченное практическое значение (поскольку это потребовало бы именования обеих форм). Поэтому в версии 2016 года они рассматриваются как единый пик Brilliant Blue.

Если пробы содержат значительные примеси, многократные анализы больших партий могут загрязнить вход в колонку, что приведет к расщеплению капель во время инжекции и появлению М-образных пиков.

Эту ситуацию относительно просто исправить: 

• Первое решение — улучшить предварительную очистку образцов для уменьшения нагрузки примесей.
• Другое решение — установить предколонку перед аналитической колонкой и регулярно менять картридж предколонки. 
• Обратная промывка колонки также может в некоторой степени помочь при таком загрязнении, но это может также вызвать вторичное загрязнение колонки, поэтому автор не рекомендует этот метод.