Оптимизация раствора фосфатного буфера: методы приготовления и примеры

Функцией буферного раствора является поддержание pH раствора в заданном диапазоне, обеспечивая соответствие кислотности испытуемого раствора требованиям аналитического метода.

Фосфатные буферные растворы с длиной волны отсечки менее 200 нм могут эффективно использоваться при более низких аналитических длинах волн. Благодаря трём значениям pKa фосфатные буферные растворы обеспечивают стабильность pH в трёх диапазонах: от 1,1 до 3,1, от 6,2 до 8,2 и от 11,3 до 13,3, что делает их одними из наиболее часто используемых буферных растворов для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях ультрафиолетового детектирования.

При приготовлении фосфатного буферного раствора обычно упоминаемая концентрация 0,01 М относится к концентрации фосфатных ионов в растворе, а не к концентрации ионов Na ⁺ или K ⁺ , которые помогают регулировать осмотическое давление.

• 0,2М Na₂HPO₄ : Точно взвесьте 28,392 г Na₂HPO₄, растворите его в 1 л воды и подвергайте воздействию ультразвука до полного растворения.
• 0,2 М NaH₂PO₄ : Точно отмерьте 23,996 г NaH₂PO₄, растворите его в 1 л воды и подвергайте воздействию ультразвука до полного растворения.

Для приготовления 0,2 М раствора фосфатного буфера (pH = 7,4, 100 мл) смешайте 81 мл 0,2 М раствора Na₂HPO₄ и 19 мл 0,2 М раствора NaH₂PO₄, тщательно перемешав. Другие концентрации 0,2 М раствора фосфатного буфера (pH = 7,4) можно получить, разбавляя этот исходный раствор по мере необходимости:

• 0,1 М PB (pH = 7,4) : разведите 500 мл 0,2 М PB водой до общего объема 1 л.
• 0,01 М PB (pH = 7,4) : разведите 50 мл 0,2 М PB водой до общего объема 1 л.
• 0,02 М PB (pH = 7,4) : разведите 100 мл 0,2 М PB водой до общего объема 1 л.

Состав 0,2М фосфатного буфера (ФБ) при различных значениях pH подробно представлен в следующей таблице.

Вышеуказанные методы подготовки служат справочными материалами.

При рутинной подготовке подвижной фазы буферные соли часто комбинируют с кислотно-основными растворами для точной регулировки pH. Использование более низких концентраций (0,1 М) для регулировки pH приводит к меньшим ошибкам, чем более высокие концентрации (1 М), что повышает повторяемость pH буфера и улучшает воспроизводимость анализов, чувствительных к колебаниям pH.

Отзывы клиентов об условиях жидкой фазы в отчёте по применению выявили нестабильную воспроизводимость разделения при использовании одной и той же системы жидкостной хроматографии. Несмотря на использование одинаковых методов подготовки подвижной фазы в разные дни, разделение иногда проходило успешно, но в других случаях пики перекрывались, что затрудняло эффективное разделение.

Исследование показало, что клиент растворял фосфатные соли в 1 л сверхчистой воды и корректировал pH, добавляя по каплям 1 М щелочной раствор. Этот подход вносил изменения в процесс приготовления, что влияло на результаты разделения пиков.

1. Точно взвесьте фосфатную соль массой ± 0,001 г и растворите ее примерно в 800 мл сверхчистой воды.
2. Подготовьте 0,1 М раствор гидроксида натрия или гидроксида калия, точно взвесив Ng ± 0,001 г, затем отмерьте 100 мл этого раствора мерным цилиндром для дальнейшего использования.
3. Медленно добавляйте приготовленный щелочной раствор к раствору фосфатной соли, следя за изменением pH. После достижения целевого pH прекратите добавление щелочного раствора и запишите израсходованный объём.
4. Доведите общий объем буферного солевого раствора до 1 л, добавив сверхчистую воду.
5. Для последующих пробоподготовок используйте записанный объём щелочного раствора, добавленного к тому же объёму буферного раствора для поддержания постоянного pH. Этот метод снижает вариабельность пробоподготовки и повышает воспроизводимость разделения пиков.

Данный метод был успешно передан клиенту, который сообщил об улучшении воспроизводимости разделения.