Типы и применение ион-парных реагентов в жидкостной хроматографии
В жидкостной хроматографии для лучшего удерживания целевого пика при анализе образцов ионных соединений при разработке метода рассматриваются ион-парные реагенты (ИПР), увеличивающие удерживание и улучшающие форму пика. Это также известно как ион-парная хроматография (ИПХ).
Типы ион-парных реагентов
На основании исторического статуса и физико-химических свойств ион-парные реагенты можно разделить на следующие типы:
Традиционные ион-парные реагенты
Это самые ранние и до сих пор наиболее часто используемые типы, включающие следующие две категории:
• Катионные ион-парные реагенты : обычно включают органические амины или соли аммония с различной длиной алкильной цепи, такие как триэтиламин и бромид тетрабутиламмония. Добавление их в подвижную фазу может улучшить удерживание анионных аналитов.
• Анионные ион-парные реагенты : распространенными примерами являются алкилсульфонаты, такие как додецилсульфат натрия и гептансульфонат натрия. Добавление их в подвижную фазу может улучшить удерживание катионных аналитов.
Летучие ион-парные реагенты
По мере того, как всё больше лабораторий оснащаются системами жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), традиционные ион-парные реагенты становятся менее летучими и несовместимыми с масс-спектрометрией (МС). Кроме того, ион-парные реагенты, добавляемые для увеличения удерживания аналита, также могут влиять на его ионизацию, что требует использования ион-парных реагентов, совместимых с МС.
Низкомолекулярные органические кислоты, такие как муравьиная и уксусная кислоты, являются часто используемыми летучими ион-парными реагентами в анализе ЖХ-МС. Они могут влиять на удерживание соединений, чувствительных к pH, изменять их заряд и обеспечивать протонирование. Кроме того, эти органические кислоты могут подавлять активность остаточных силанольных групп на хроматографической колонке, что положительно сказывается на форме пика.
Если аналиты нестабильны в кислой среде или плохо разделяются при низком pH, могут потребоваться более нейтральные условия. В таких случаях используются летучие соли, такие как формиат аммония и ацетат аммония. pH этих солей позволяет проводить детектирование как с положительными, так и с отрицательными ионами. Важно учитывать растворимость этих солей в органических растворителях, особенно в ацетонитриле.
В пептидном и аминокислотном анализе увеличилось использование перфторкарбоновых кислот (таких как трифторуксусная кислота (ТФУК), гептафтормасляная кислота (ГФМК) и пентафторпропионовая кислота (ПФПК)). Эти реагенты также способны подавлять силанольную активность и улучшать форму пиков. ТФУК широко используется благодаря хорошей растворимости в воде и низкой длине волны отсечки. ГФМК, селективность которой отличается от ТФУК и ПФПК, также используется в сочетании с масс-спектрометрией, но может несколько загрязнять масс-спектрометр.
Хаотропные агенты
Хаотропные агенты – это соли, способные разрушать водородные связи между молекулами воды и увеличивать их разупорядоченность. В ионно-парной хроматографии типичными примерами являются перхлораты, гексафторфосфаты и тетрафторброматы. Добавление подходящих хаотропных агентов может повысить гидрофобность ионных аналитов, тем самым улучшая их удерживание.
Меры предосторожности
1) В некоторых случаях необходимо строго контролировать pH подвижной фазы и температуру колонки во время детектирования. Кроме того, подвижные фазы, содержащие летучие ион-парные реагенты, рекомендуется готовить ниже поверхности растворителя во избежание проблем с воспроизводимостью.
2) При использовании ион-парных реагентов в подвижной фазе может наблюдаться одновременное появление положительных и отрицательных пиков, что может помешать разработке метода или проведению рутинного анализа. Такие проблемы, в первую очередь, связаны с использованием загрязненных ион-парных реагентов, буферных солей или других добавок подвижной фазы. Примеси в ион-парных реагентах также могут влиять на время удерживания аналитов.
3) При использовании подвижных фаз, содержащих ион-парные реагенты, особенно с сильной гидрофобностью, уравновешивание колонки может происходить медленно. Недостаточное время уравновешивания может привести к дрейфу времени удерживания и нестабильным результатам. Для подвижных фаз, содержащих ион-парные реагенты, обычно рекомендуется использовать изократические условия элюирования, поскольку градиентное элюирование может привести к флуктуациям базовой линии и проблемам с воспроизводимостью удерживания. Чтобы обеспечить достижение хроматографической колонки хорошего равновесного состояния, перед использованием рекомендуется уравновешивать колонку при низкой скорости потока в течение ночи.
4) Более слабые ион-парные реагенты, такие как ТФУ, ПФФА и элюирующие агенты, не замедляют процесс уравновешивания колонки. Обычно для достижения равновесия достаточно уравновешивания подвижной фазы в объеме 10–20 объемов колонки.
5) Если образец содержит как кислотные, так и основные соединения, оба типа реагентов IPC могут быть эффективны, но их не следует добавлять в подвижную фазу одновременно. Эти реагенты могут образовывать между собой ионные пары, что может нивелировать их суммарный эффект разделения, а одновременное использование обоих реагентов усложняет разработку метода.
6) При селективном увеличении удерживания основных растворенных веществ предпочтительным реагентом ИПК следует считать алкилсульфонаты, тогда как при увеличении удерживания кислых растворенных веществ используют соли тетрабутиламмония.
