Сравнение колонок амино (NH2) и колонок сахаров в анализе углеводов
Введение
Углеводы , как жизненно важный источник энергии и промежуточные продукты метаболизма в живых организмах, всегда были в центре внимания. Благодаря непрерывному технологическому прогрессу последних лет, исследования углеводов получили беспрецедентные возможности для развития, значительно расширив как глубину, так и масштаб исследований.
Углеводы — органические соединения, состоящие из углерода, водорода и кислорода. Они широко распространены в природе в виде полигидроксиальдегидов, кетонов и их производных. По составу и структуре углеводы можно разделить на моносахариды, олигосахариды и полисахариды :
- Моносахариды: простейшая форма углеводов, такая как глюкоза и фруктоза.
- Олигосахариды: небольшие молекулы, состоящие из 2–10 моносахаридных единиц, конденсированных путем дегидратации, такие как мальтоза и сахароза.
- Полисахариды: крупные молекулы, образованные путем дегидратационной конденсации многих моносахаридных единиц, таких как крахмал и целлюлоза.
Расширение сферы исследований углеводов
В XXI веке исследования углеводов распространились на множество областей, включая науки о жизни, материаловедение и энергетику. По мере развития наук о жизни взаимодействие углеводов с биомакромолекулами стало одним из основных направлений исследований.
Например, углеводы играют важную роль в синтезе и модификации биологических макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Кроме того, углеводы участвуют в клеточном распознавании, передаче сигналов и иммунных реакциях.
Основные категории анализа углеводов
Анализ углеводов обычно делится на две категории:
- Разделение моносахаридов, дисахаридов и олигосахаридов.
- Анализ молекулярной массы и распределения полисахаридов.
Для анализа углеводов в жидкостной хроматографии обычно используются колонки с аминогруппами ( NH2 ) . Однако с развитием хроматографических технологий ассортимент колонок, доступных для анализа углеводов, расширился.
Сульфированные колонки на основе сополимера стирола и дивинилбензола стали основным средством для определения углеводов. Эти полимерные сульфированные колонки подразделяются на водородные (например, SUGAR-H ), кальциевые (например, SUGAR-Ca ), натриевые и т. д.
Как при таком большом выборе выбрать правильную колонку для анализа углеводов?
Плюсы и минусы колонн NH 2 и сахарных колонн
Требования к детектору:
Для обнаружения молекул углеводов обычно используются дифференциальные рефрактометрические детекторы. Для обеспечения чувствительности обнаружения таким детекторам требуется определённая концентрация образца. Следовательно, образец должен иметь относительно высокую концентрацию.
Различия в подвижной фазе:
Подвижной фазой для колонок с сахаром служит чистая вода или водный раствор серной кислоты. Углеводы, как правило, хорошо растворяются в этих растворителях. В то же время, подвижной фазой для колонок с NH₂ обычно является смесь ацетонитрила и воды в соотношении 70:30.
Однако, если образец содержит несколько углеводов или имеет высокую концентрацию, использование смеси ацетонитрила и воды в соотношении 70:30 для разбавления образца может привести к образованию осадка из-за разницы в растворимости, что негативно скажется на разделении и точности определения. Также не рекомендуется использовать для разбавления чистую воду, поскольку влияние растворителя может привести к аномальной форме пиков.
Кроме того, с экономической и экологической точки зрения колонны с сахаром более экономичны и экологичны, поскольку в них не используются органические растворители, такие как ацетонитрил.
Настройка прибора:
Для колонок с сахаром требуется температура выше 70°C, и некоторые термостаты колонок ВЭЖХ могут не достигать этих температур. Поэтому колонки с сахаром могут потребовать более высоких затрат на оборудование по сравнению с колонками с NH2 .
Долговечность столбца:
Фаза с аминогруппами может быть нестабильной в кислой среде, а колонки на основе силикагеля могут разрушаться в щелочной среде. Восстанавливающие сахара, такие как глюкоза, фруктоза, мальтоза и лактоза, могут реагировать с аминогруппами, вызывая отсоединение или денатурацию аминогрупп, что значительно сокращает срок службы колонок с NH₂ .
Колонки на основе сахара, с другой стороны, изготовлены на основе сополимеров стирола и дивинилбензола, которые имеют более низкую степень сшивки и, следовательно, меньшую механическую прочность по сравнению с колонками на основе силикагеля. Во время использования скорость потока должна поддерживаться в пределах 0,2–0,3 мл/мин до достижения колонкой заданной температуры. Чрезмерная нагрузка может повредить слой колонки, поэтому скорость потока следует изменять с шагом 0,1 мл/мин, чтобы избежать выхода колонки из строя.
Различия в механизмах разделения:
В колонках с сахаром используется преимущественно механизм координационного обмена. Этот механизм использует взаимодействие между гидроксильными группами молекул углеводов и ионами металлов в фазе колонки (т.е. энергию координационного обмена) для достижения разделения. Углеводы с различным числом гидроксильных групп и различной пространственной структурой имеют различную энергию координационного обмена, что обеспечивает эффективное разделение.
Прочность координационной связи также зависит от типа иона металла. В настоящее время доступны колонки с Ag + , Li + , Na + , Zn2 + , Ca2 + , Ba2 + и Pb2 + , с возрастающей прочностью связи в этом порядке. Колонки с NH2, напротив, используют аминопропильные группы в качестве основной функциональной группы и разделение основано на гидрофильных взаимодействиях.
Таким образом, колонки с NH₂ выгодны для одновременного разделения углеводов с различной степенью полимеризации, таких как моносахариды, дисахариды и трисахариды. Колонки с сахарами лучше подходят для разделения моносахаридов, органических кислот и сахарных спиртов. Однако при степени полимеризации выше четырёх (4) эффективность разделения на колонках с сахарами имеет тенденцию к снижению.
Наблюдения за эффективностью разделения
На рисунке 1 показано, что колонки NH 2 испытывают трудности при разделении моносахаридов от моносахаридов или дисахаридов от дисахаридов, но они хорошо справляются с разделением моносахаридов от дисахаридов.
На рисунках 2 и 3 показаны различия в эффективности разделения сахаров и сахарных спиртов между колонками с кальциевым типом и колонками с NH 2 . Колонки с NH 2 с трудом разделяют сахарные спирты от сахаров, тогда как на кальциевых колонках сахарные спирты элюируются позже, чем сахара (например, мальтоза и мальтит плохо разделяются на колонках с NH 2 , но полностью разделяются на кальциевых колонках).
Поэтому для разделения сахаров и сахарных спиртов рекомендуется использовать колонки с сахаром. Более того, исследования показывают, что по мере повышения степени полимеризации эффекты эксклюзии приводят к снижению удерживания, что приводит к снижению разрешения на кальциевых колонках.
На рисунке 4 колонки Sugar-H и Sugar-Ca демонстрируют различную селективность при разделении сахаров и сахарных спиртов. В большинстве случаев Sugar-H используется для разделения различных органических кислот.
Однако сульфоновые группы в Sugar-H могут катализировать разложение некоторых сахаров (например, сахарозы и раффинозы). Скорость разложения увеличивается с повышением температуры, поэтому рекомендуется использовать колонки Sugar-H при температурах ниже 40°C.
Сопутствующие товары
Примечание: здесь представлены не все характеристики товаров. Воспользуйтесь функцией поиска , чтобы найти товары с нужными вам параметрами.