Ключевые концепции и аспекты препаративной жидкостной хроматографии
Оглавление
Введение
Препаративная жидкостная хроматография (препаративная ЖХ) — это специализированный метод разделения и очистки известных или неизвестных веществ. Хотя препаративная ЖХ обсуждается реже, чем аналитическая жидкостная хроматография, она играет важнейшую роль в исследованиях и производстве, обеспечивая значительные преимущества во многих областях применения, связанных с образцами высокой чистоты.
Ниже мы рассмотрим 10 основных аспектов Prep LC в форме вопросов и ответов, обращаясь к этим ключевым аспектам для эффективной реализации.
1. Что такое препаративная жидкостная хроматография?
Препаративная жидкостная хроматография — это метод разделения и очистки соединений, основанный на их взаимодействии с хроматографической колонкой. Он широко применяется в таких областях, как химия и биология, где требуется высокая чистота. Система включает в себя несколько компонентов, включая резервуар для растворителя, насос высокого давления, инжектор, препаративную колонку, детектор и коллектор фракций.
2. Каковы основные области применения препаративной жидкостной хроматографии?
Препаративная ЖХ в основном используется для очистки высококачественных образцов, в частности, для выделения фармацевтических примесей и других химических соединений. В отличие от традиционных методов очистки (таких как колоночная хроматография, дистилляция или кристаллизация), препаративная ЖХ отличается высокой эффективностью, обеспечивает более быструю обработку, более высокую чувствительность и минимальную деградацию образца.
| Шкала очистки | Целевой вес | Приложения |
|---|---|---|
| Аналитическая шкала | мкг | Разделение ферментов, пептидов, биомакромолекул и других соединений в ходе небольших фармацевтических исследовательских экспериментов. |
| Полупрепаративный | мг | Маломасштабные биопробы, структурный анализ и характеристика метаболитов. |
| Препаративный | г | Выделение и обогащение аналитических стандартных образцов, токсикологические исследования, скрининг химической библиотеки и высокочистые основные компоненты/побочные продукты. |
| Промышленные масштабы | кг | Промышленное производство фармацевтических препаратов и активных соединений. |
3. В чем различия между аналитической и препаративной жидкостной хроматографией?
Хотя принципы аналитической и препаративной жидкостной хроматографии одинаковы, их цели различаются.
| Аналитическая ЖХ | Важность | Препаративная ЖХ | Важность |
|---|---|---|---|
| Качественный анализ | ☆☆ | Чистота | ☆☆ |
| Количественный анализ | ☆☆ | Скорость восстановления | ☆☆ |
| Форма пика | ☆ | Пропускная способность | ☆☆ |
| Разрешение | ☆ | Удобство после приготовления | ☆ |
| Чувствительность | ☆ | Стабильность | ☆ |
| Согласие | ☆ | Расходы | ☆ |
Аналитическая хроматография фокусируется на качественном и количественном анализе, стремясь к высокой эффективности разделения и чувствительности, как правило, с использованием сверхчувствительных детекторов нанограммового или петаграммового уровня, способных обнаруживать следовые количества. В отличие от этого, препаративная хроматография делает ставку на высокую производительность и чистоту образца, стремясь оптимизировать извлечение, загрузку образца и чистоту, одновременно балансируя скорость и расход растворителя.
| Аспект | Аналитическая ЖХ | Препаративная ЖХ |
|---|---|---|
| Цель | Качественный/количественный анализ | Разделение и очистка |
| Фокус | Чувствительность и разрешение | Эффективность |
| Функция | Анализ | Удалить примеси |
| Типичный расход | 10 мл/мин | Полупрепаративный: 50 мл/мин Препаративный: ≥100 мл/мин |
| Конфигурация | Насос, пробоотборник, аналитическая колонка, термостат колонки, детектор | Насос, пробоотборник, препаративная колонка, детектор, коллектор фракций |
| Пост-эксперимент | Н/Д | Дополнительный анализ (например, ЯМР) |
4. Каковы принципы и рабочий процесс препаративной жидкостной хроматографии?
Принцип препаративной ЖХ прост: после загрузки образца подвижная фаза проталкивает компоненты через неподвижную фазу. В зависимости от своих химических свойств соединения по-разному взаимодействуют с неподвижной фазой, что приводит к разным временам удерживания. Эти взаимодействия позволяют разделять соединения, которые затем элюируются из колонки в разное время.
Рабочий процесс эксперимента
5. Каковы основные параметры препаративной жидкостной хроматографии?
Успех препаративной хроматографии определяется тремя основными параметрами: чистотой , степенью извлечения и нагрузкой образца . Они взаимосвязаны, и оптимизация одного из них часто влияет на другие. Баланс этих параметров критически важен, поскольку достижение максимальной чистоты иногда может негативно сказаться на степени извлечения, а более высокая нагрузка образца может повлиять на эффективность разделения.
6. Как классифицируется препаративная жидкостная хроматография?
Препаративную ЖХ можно классифицировать на основе условий давления в системе:
- Системы низкого давления (<2 МПа): подходят для соединений, которые легко разделяются, но требуют более длительного времени обработки, что может привести к деградации образца.
- Флэш-хроматография (<1 МПа): более быстрая альтернатива системам низкого давления, хотя и с более низким разрешением, чем системы среднего давления, обычно используемые для простых разделений.
- Системы среднего давления (<5 МПа): обеспечивают более высокое разрешение и более быстрое разделение с использованием более мелких частиц насадки. Для обеспечения постоянного расхода подвижной фазы часто используются насосы постоянного расхода.
- Системы высокого давления (>5 МПа): используются на конечных этапах очистки, способны выдерживать более высокое давление и достигать уровня чистоты более 99,9%, справляясь со сложными разделениями.
Давление в системе зависит от режимов разделения и требований к чистоте анализа. Как правило, системы низкого давления, среднего давления и флэш-хроматографии можно объединить в систему среднего и низкого давления.
7. Как выбрать подвижные фазы для препаративной жидкостной хроматографии?
Выбор правильной подвижной фазы имеет решающее значение для оптимизации разделения. Она должна:
- Обеспечить хорошее разрешение и селективность целевого соединения.
- Быть летучим для удобства последующей обработки.
- Имеют низкий остаток, что гарантирует содержание продукта.
- Имеют низкую вязкость, что позволяет снизить давление в колонне.
- Быть совместимым со спектральными свойствами детектора.
- Быть недорогим и химически инертным.
Значения pH обычных летучих буферных солей | |
|---|---|
| ТФА | <2.2 |
| Муравьиная кислота | 2.8-4.8 |
| Уксусная кислота | 3.8-5.8 |
| Формиат аммония | 3.0-5.0 |
| Ацетат аммония | 3.8-5.8 |
| карбонат аммония | 5,5-7,5 |
| Бикарбонат аммония | 8.3-10.3 |
| Раствор аммиака | 8.2-10.2 |
К распространённым растворителям относятся (отсортируйте по силе растворения от самой слабой к самой сильной): вода, метанол, ацетонитрил, этанол, тетрагидрофуран (ТГФ), пропанол и дихлорметан. Эти растворители, за исключением дихлорметана, можно смешивать с водой для получения обращённо-фазовой системы.
Принимая во внимание процесс экстракции после хроматографического разделения, следует избегать использования высококипящих растворителей, высокотоксичных растворителей и поливалентных растворителей с большой разницей в плотности.
8. Каковы методы последующей обработки и связанные с ними распространенные проблемы?
После разделения фракции часто требуют дополнительной обработки. К распространённым методам относятся:
- Лиофилизация (сублимационная сушка)
- Роторное испарение
- Сочетание лиофилизации и роторного испарения
- Жидкостно-жидкостная экстракция
- Твердофазная экстракция
К основным задачам относятся обеспечение стабильности фракций, удаление солей и предотвращение деградации чувствительных соединений под воздействием света.
9. Что такое концентрационная перегрузка и перегрузка объемом?
Перегрузка по концентрации возникает, когда концентрация образца слишком высока при вводе малого объёма, что приводит к насыщению неподвижной фазы и размыванию пика или снижению разрешения. В этом случае форма пика становится треугольной, а не гауссовой. Перегрузка по концентрации допускается только при хорошей растворимости образца в подвижной фазе.
Перегрузка по объёму происходит, когда объём образца превышает ёмкость колонки, что приводит к широким пикам и плохому разрешению. Это особенно заметно на соединениях с коротким временем удерживания.
Оба типа перегрузки снижают эффективность разделения и должны тщательно контролироваться при разработке метода. Повышение селективности также увеличивает максимальную загрузку образца за один цикл.
10. Как рассчитать масштабирование при разработке метода препаративной жидкостной хроматографии?
В аналитической хроматографии нагрузка образца на колонку обычно составляет порядка микрограммов или даже меньше, при этом соотношение массы соединения к массе неподвижной фазы составляет менее 1:100 000. Объём вводимого образца также значительно меньше объёма колонки (<1:100). В таких условиях можно получить острые и симметричные пики.
Однако в препаративной ЖХ загрузка образца существенно выше. Пропорциональное масштабирование аналитической системы и перегрузка колонки — два основных подхода к очистке больших количеств образца.
Метод перегрузки колонки позволяет разделять образцы на уровне миллиграммов даже на аналитических колонках, и процесс можно пропорционально масштабировать для подготовки больших объемов образцов.
Оптимизация и масштабирование аналитического метода до препаративного метода в три этапа:
- Оптимизация разрешения в аналитическом методе.
- Выполнить перегрузку столбцов для аналитического столбца.
- Масштабирование до препаративной колонки.
Расчет пропорционального масштабирования
При переходе от колонки с меньшим внутренним диаметром к колонке с большим диаметром необходимо увеличить два ключевых параметра: скорость потока и загрузку образца.
Формула оценки нагрузки массы образца:
где
- M 2 = максимально допустимая нагрузка образца на препаративную колонку,
- D 2 = диаметр препаративной колонки,
- L 2 = длина препаративной колонки,
- M 1 = максимальная нагрузка образца на аналитическую колонку,
- D 1 = диаметр аналитической колонки,
- L 1 = длина аналитической колонки.
Формула расчета объема вводимой пробы:
где
- V 2 = максимально допустимый объем образца на препаративной колонке,
- D 2 = диаметр препаративной колонки,
- L 2 = длина препаративной колонки,
- V 1 = максимальный объем образца на аналитической колонке,
- D 1 = диаметр аналитической колонки,
- L 1 = длина аналитической колонки.
Формула для расчета расхода:
где
- F 2 = скорость потока препаративной колонки,
- F 1 = скорость потока аналитической колонки,
- D 2 = диаметр препаративной колонки,
- D 1 = диаметр аналитической колонки.